【摘要】：輪狀病毒(Rotvaiurs)引起的感染是全世界范圍內,導致嬰幼兒或幼畜病毒性腹瀉的最主要原因。據(jù)統(tǒng)計,在發(fā)展中國家,由輪狀病毒感染導致的兒童腸胃炎和脫水死亡達到60萬-80萬人/年。目前,人或動物受到輪狀病毒的感染后,無有效治療手段,利用葡萄糖等可暫時性補充腹瀉引起的體液水平下降,但無法從根本上消除病毒的危害,由此造成的社會影響與家庭經(jīng)濟負擔巨大。因此,研制一種安全而高效的輪狀病毒疫苗,是人類健康所面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。本研究從專利(US 7,285,280B1)獲得人輪狀病毒株外殼蛋白VP7基因序列(HRVVP7),針對大腸桿菌密碼子偏好設計合成HRVVP7基因序列,構建原核表達載體pET-22b-HRVVP7,在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達。HRVVP7蛋白在包涵體和可溶性部分中,都有不同程度表達,優(yōu)化BL21(DE3)誘導表達條件,確定誘導溫度30℃,誘導時間9 h,IPTG誘導濃度1.0mM,為可溶性蛋白表達的最佳條件。鎳柱親和層析法純化獲得純化的HRVVP7蛋白,為后續(xù)植物表達水平檢測提供標準品蛋白。針對擬南芥密碼子偏好設計合成HRVVP7-linker-CTB基因,以其為模板通過PCR方法獲得優(yōu)化的HRVVP7核酸序列,成功構建植物表達載體pPhaP3301-HRVVP7-linkerCTB和pPhaP3301-HRVVP7。農(nóng)桿菌介導侵染擬南芥,草銨膦篩選獲得陽性轉基因擬南芥植株,Western blotting和ELISA檢測和定量獲得高表達量的T3代轉基因擬南芥種子。為探索植物反應器多種途徑生產(chǎn)HRVVP7,本研究利用紅花組織培養(yǎng)技術,通過農(nóng)桿菌介導轉化pPhaP3301-HRVVP7至紅花子葉中,對成活植株進行PCR驗證,陽性植株收獲種子后繼續(xù)擴繁。收獲T3代穩(wěn)定遺傳的轉基因紅花種子,通過SDS-PAGE、Western Blotting對HRVVP7蛋白進行檢測和定性,利用ELISA定量分析,為植物生產(chǎn)輪狀病毒疫苗提供新的可行途徑。利用含有HRVVP7-linker-CTB與HRVVP7轉基因擬南芥種子,提取可溶性總蛋白,經(jīng)含量測定后免疫小鼠,分析本實驗所制備植物疫苗的免疫效果。HVVP7-linker-CTB與HRVVP7轉基因擬南芥種子蛋白樣本,免疫組小鼠均能產(chǎn)生唾液、糞便、小腸粘膜IgA抗體與血清IgG抗體;血清IgG抗體具有較好的病毒中和能力;HRVVP7-linker-CTB與HRVVP7轉基因擬南芥種子蛋白,免疫小鼠能夠被動免疫子代小鼠。HRVVP7融合CTB蛋白在動物免疫實驗中表現(xiàn)出優(yōu)于HRVVP7蛋白效果。本研究首次在擬南芥及紅花中表達了HRVVP7(US 7,285,280B1)基因,比較了融合CTB前后免疫效果的差異。實驗為植物生物反應器生產(chǎn)輪狀病毒亞基疫苗奠定了基礎。
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;R392
【圖文】：

在胰蛋白酶和胰凝乳酶等蛋白水解酶的輔助處理后，才能適合綠猴腎細胞、非洲綠猴腎細胞、MA104（現(xiàn)被更正為是非洲狀病毒常用的細胞系。具有很強的傳染性，在水體表面可存活數(shù)周，對理化因素變化仿、乙醚等有機試劑，反復凍融，超聲波處理及 37℃下 1 小H 3.5-10.0范圍內仍可保持感染力。臭氧、碘、氯、酚等試劑

圖 1.1 輪狀病毒粒子(標記代表 100um)（摘自文獻[13]）Fig.1.1 Virions of rotavirus (Marker represents 100 microns)毒蛋白特征，人們已經(jīng)從完整的輪狀病毒顆粒中鑒定出 11 種蛋白，分別VP6、VP7、NSPI、NSP2、NSP3、NSP4、NSPS[14]，分屬于白（見圖 1.2）。其中，結構蛋白 VP1、VP2、VP6、VP7 是毒的結構和功能的主要蛋白。VP1、VP2、VP3、NSPI、N 結合蛋白，對基因組的復制、合成及表達產(chǎn)生影響[15]。

進入臨床試驗階段的疫苗，中國的人-羊基因重配減毒活疫苗已經(jīng)完驗；UK基因重配 4價牛輪狀病毒株疫苗（NIH,USA）；RV3新生兒人輪TBD, Australian)；新生兒人輪狀病毒株疫苗（Bharat, USA/Indian)。已經(jīng)病毒疫苗為 RIT－4237 牛輪狀病毒株疫苗（Smithnine, Belgium）；WC3 苗（Wistar/Merenx, USA/France)； MMV-18006 猴輪狀病毒株疫苗（NIHield 基因重配猴輪狀病毒疫苗（Wyeth Lederle, USA）。目前，輪狀病毒三個主要階段：

【參考文獻】

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本文編號：2796011