【摘要】：高等真核細胞的內(nèi)層核膜下存在著一個纖維網(wǎng)絡狀的蛋白質(zhì)片層結(jié)構,稱為核纖層,其主體成分為核纖層蛋白(lamin)。Lamin是唯一的細胞核中間纖維,也是中間纖維超家族中最古老的類型,在后生動物中廣泛存在并高度保守。人類基因組中有3個lamin基因:LMNA、LMNB1和LMNB2,其中LMNA通過可變剪接產(chǎn)生兩種主要A型成員LMNA和LMNC,其表達受發(fā)育進程調(diào)控,而兩種B型基因組成型表達,是細胞的必需基因。除LMNC外,其余3種蛋白的C末端均經(jīng)歷特殊的翻譯后修飾。磷酸化是調(diào)節(jié)這些蛋白活性的重要手段,介導細胞周期中核纖層的可逆組裝。Lamin可與多種內(nèi)層核膜或核質(zhì)蛋白直接或間接相互作用,通過這些功能各異的相關蛋白,作為結(jié)構分子的lamin,其功能也拓展到了細胞生命活動的各個方面,在DNA復制與修復、染色質(zhì)組織、基因調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導等過程中均扮演著重要角色。Lamin基因突變或表達異�？蓪е露喾N臨床表型高度異質(zhì)的人類遺傳性疾病,包括以進行性肌萎縮為主要特征的Emery-Dreifuss肌營養(yǎng)不良(Emery-Dreifuss muscular dystrophy,EDMD)和肢帶型肌營養(yǎng)不良 1B 型(limb girdle muscular dystrophy type 1B,LGMD1B),以及造成小孩快速衰老的早衰癥(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)。這些疾病統(tǒng)稱為核纖層蛋白病,LMNA突變?yōu)橹饕∫�。雖然LMNA/C在成體中廣泛表達,核纖層蛋白病卻呈現(xiàn)出一定的組織特異性,根據(jù)受累的器官組織可分為5種類型:橫紋肌疾病、脂肪營養(yǎng)不良、神經(jīng)疾病、早衰和混合型。組蛋白分子伴侶RBBP4/7的丟失是HGPS和自然衰老進程中的重要事件,而在分別表現(xiàn)為EDMD和LGMD1B的兩位患者的原代成肌細胞中,RBBP4/7也出現(xiàn)定位或表達異常,表明其可能是多種核纖層蛋白病的共有病理因子。模式生物秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中,RBBP4/7有兩個同源蛋白——LIN-53和RBA-1,其中l(wèi)in-53的干涉或突變可導致線蟲肌肉缺陷和壽命縮短,也即具有類似核纖層蛋白病的表型,因此我們希望能以C.elegans為疾病模型探究lin-53/rba-1與核纖層蛋白病的關系,同時利用C elegans的活體高通量優(yōu)勢進一步解析核纖層蛋白病的致病機制,為治療提供新的思路和更多的可能。C.elegans體壁肌肉的結(jié)構和功能與脊椎動物骨骼肌高度相似,為其被作為橫紋肌疾病模型提供了可行性。于是,我們將EDMD和LGMD1B的致病突變引入了 C.elegans的單個lamin基因lmn-1,通過顯微注射法構建了肌肉特異性表達的轉(zhuǎn)基因嵌合株,隨后以γ射線照射法獲得了轉(zhuǎn)基因整合株。通過游泳實驗、免疫染色和Pmyo-3::GFP報告基因等證實這些轉(zhuǎn)基因突變體重現(xiàn)了兩位患者的肌肉缺陷表型,成功獲得了 EDMD和LGMD1B的線蟲模型。而壽命實驗顯示,突變體的生存能力所受影響較小。我們還通過MosSCI法獲得了單拷貝定點整合的轉(zhuǎn)基因突變體,在lmn-1-/-背景下也出現(xiàn)了肌肉表型。另外,我們還構建了廣泛表達的轉(zhuǎn)基因突變體,并觀察到腸細胞核的形態(tài)異常。另一方面,通過LIN-53和RBA-1的表達模式檢測,我們發(fā)現(xiàn)野生型N2雌雄同體成蟲中LIN-53廣泛表達,而RBA-1卻局限在生殖系細胞中,也即LIN-53獨自承擔成體肌細胞功能。功能性融合蛋白GFP::LIN-53::2xFLAG的外源表達表明LIN-53對肌肉穩(wěn)態(tài)具有重要作用。免疫染色顯示,在EDMD和LGMD1B突變體,以及具有早衰表型的lmn-1-/-純合子中,LIN-53的表達均出現(xiàn)下降或缺失,表明其可能是多種核纖層蛋白病的共有病理因子,且這一機制可能在進化上保守。此外,我們還利用MH染色質(zhì)亞庫對～700個線蟲基因進行了 RNAi篩選,獲得了 3個經(jīng)敲低后可以緩解突變體肌肉表型的因子,且這種抑制效應由游泳實驗進一步證實。綜上所述,本研究建立了 EDMD和LGMD1B的線蟲疾病模型,發(fā)現(xiàn)組蛋白分子伴侶LIN-53可能是一種共有病理因子,并篩選出3個核纖層蛋白病相關因子,為進一步解析核纖層蛋白病的分子機制和治療藥物開發(fā)等后續(xù)研究提供了基礎和依據(jù)。
【學位授予單位】：東北林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R596;R-332
【圖文】：

（１）ＬＭＮＡ逡逑ＺＭＶｄ位于常染色體ｌｑ２２，基因組全長為５７．５邋ｋｂ，含有１７個外顯子序列（ＮＣＢＩ逡逑ｇｅｎｅ邋ＩＤ：邋４０００）。經(jīng)典ＺＭＶ＾，也即ＬＭＮＡ／Ｃ的編碼基因，由１２個外顯子組成（圖１－逡逑２），產(chǎn)生至少４種異構體：Ａ、ＡＡ１０、Ｃ和Ｃ２。逡逑ｐｒｅＬＭＮＡ邋ｓｐｌｉｃｅ邋ｓｒｔｅ逡逑ｓ，—邐ｆ邐＇…，邐＇邋—－邋３，逡逑ｌｍｎａ邋Ｈ邐—Ｗｕ—￣Ｈｍ—￣１２邋＿ｒ逡逑：＼邐＼邐ｔ邐＼逡逑／邋；邐＼邐ＬＭＮＣ邋Ｂ＾ＴＲ邐＼逡逑，■邋／邋；邋＼邋＼逡逑ｌ邋＊‘邐、邐＼逡逑３３邐３８３邐６６４逡逑ｐｒｅＬＭＮＡ邋二——一：｜逡逑ＣｏｉｌｌＡ邐ＣｏｉｌｌＢ邐Ｃｏｉｌ２Ａ邐Ｃｏｉｌ２Ｂ邐ＮＬＳ邐ｉｇ－ｆｏ！ｄ邐ＣａａＸ逡逑３３邐３８３邐Ｓ７２逡逑ＣｏｉｌｌＡ邐Ｃｏｉ�。保高姡茫铮椋欤玻吝姡茫铮椋妫玻逻姡危蹋舆姡桑纾妫铮欤溴义蠄D１－２邋ＺＭＡＭ基因和主要產(chǎn)物示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｉＬＭＮＡ邋ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｍａｊｏｒ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ逡逑ＬＭＮＡ／Ｃ的編碼基因又＿由１２個外顯子組成，通過外顯子１０內(nèi)的選擇性剪接生成兩種主要產(chǎn)物逡逑ｐｒｅＬＭＮＡ和ＬＭＮＣ，二者的３個結(jié)構域的末端氨基酸殘基位置標在各自上方，結(jié)構組成同圖１－１。逡逑ＬＭＮＡ以前體的方式表達

有絲分裂位點的磷酸基團由蛋白a愃崦福卞澹ǎ穡潁錚簦澹椋鑠澹穡瑁錚螅穡瑁幔簦幔螅邋澹�，ＰＰ１）去除，使辶x希歟幔恚椋畹靡栽詵至涯┢冢紓牽逼諼譜湃ヅㄋ醯娜舊逯匭倫樽拔危蹋郟矗�，４ＡP蕁ｅ義賢ü鵂蹲芭�，e幔恚椋羈稍諤逋庾宰樽拔腫酉宋峁梗郟�，４８，邋４９Ｋ|繽跡保此荊海保╁義鮮紫扔閃礁齙ヌ澹ǎ恚錚睿錚恚澹潁┩ü俗辭醞蚱叫星葉云氳姆絞獎舜瞬菩緯啥厶邋義希ǎ洌椋恚澹潁╁澹誨澹玻┒喔齠厶逡宰菹蟯肺蠶嘟櫻ǎ瑁澹幔洌簦錚簦幔椋歟┑姆絞叫緯紗樽吹畝嗑厶邋義希ǎ穡錚歟恚澹潁誨澹常┝礁黽遠嗑厶逶僖苑聰蚱叫卸糠紙淮淼姆絞講⑴拋樽拔羌緣乃膩義暇厶逶宋ǎ穡潁錚簦錚媯椋歟幔恚澹睿簦誨澹矗持粒錘宋舜瞬嘞蜃樽拔�？１０邋ｎｍ的ＩＦ结构。需指辶x銑齙氖牽庖蛔樽跋附詮楣τ諦闕鉅訟叱媯澹澹紓幔潁幔┑模蹋停危卞文殼板義銜ㄒ灰桓隹梢栽諤逋庾樽拔桑平峁溝模歟幔恚椋�。茰O歟幔恚椋罱瞿茉詼嗑厶宓幕∩獻鶯嶠誨義洗砦行虻淖季逑宋ǎ穡幔潁幔悖潁螅簦幔歟歟椋睿澹媯椋猓潁澹

本文編號：2796012