【摘要】：目的海馬在空間學(xué)習(xí)、工作記憶及情境學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)中起到重要作用,對(duì)海馬的發(fā)育和修復(fù)的探索也是中樞神經(jīng)的研究重點(diǎn)。以海馬-嗅覺(jué)通路的探索為治療海馬相關(guān)疾病提供思路嗅覺(jué)-嗅結(jié)節(jié)、嗅覺(jué)-內(nèi)嗅皮質(zhì)、嗅覺(jué)-杏仁核海馬通路及嗅覺(jué)-海馬通路是嗅覺(jué)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的四大重要通路。海馬參與下的學(xué)習(xí)對(duì)海馬突觸和神經(jīng)元發(fā)育有可塑性作用。以新生鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象建立早期嗅覺(jué)學(xué)習(xí)模型以觀察海馬的功能活動(dòng)和發(fā)育狀況來(lái)探索相關(guān)影響因素。通過(guò)嗅覺(jué)對(duì)初級(jí)、次級(jí)腦環(huán)路進(jìn)行刺激并激活相關(guān)腦區(qū)。在激活神經(jīng)干細(xì)胞后經(jīng)過(guò)嘴側(cè)遷移流(Rostral migratory stream,RMS)將神經(jīng)元輸送至其他腦區(qū),為神經(jīng)修復(fù)提供幫助。這一研究以兒童發(fā)育入手為指導(dǎo)成年人腦功能修復(fù)如阿爾茨海默癥提供依據(jù)。微高壓氧(Micro-Hyperbaric oxygen,Micro-HBO)是微壓香氧體系的重要組成部分,在整合醫(yī)學(xué)中具有重要地位。實(shí)驗(yàn)討論微高壓氧干預(yù)對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能及梗死面積的影響,探索微高壓氧干預(yù)下梗死側(cè)海馬區(qū)內(nèi)與軸突發(fā)育密切相關(guān)的生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP-43)的表達(dá)變化。為探索臨床腦缺血康復(fù)方法提供思路。第一部分早期氣味學(xué)習(xí)誘導(dǎo)新生大鼠海馬細(xì)胞增殖和軸突發(fā)育方法將出生6-7d(PN6-PN7)和出生后23-24d(PN23-PN24)的SD大鼠分別隨機(jī)分為生理鹽水+香草醛氣味暴露組、生理鹽水+乙醇?xì)馕侗┞督M、LiCl+香草醛聯(lián)合學(xué)習(xí)組、LiCl+乙醇聯(lián)合學(xué)習(xí)組和對(duì)照組(LiCl組)。各組大鼠接受2d學(xué)習(xí),于最后一次學(xué)習(xí)后以Y型迷宮觀察嗅覺(jué)偏好。為了解海馬細(xì)胞增殖水平,采用BrdU標(biāo)記2h內(nèi)齒狀回增殖細(xì)胞數(shù),免疫印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)c-fos和GAP-43的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1.Y型迷宮:PN7和PN24聯(lián)合學(xué)習(xí)組的大鼠均較對(duì)照組對(duì)條件氣味表現(xiàn)出較強(qiáng)的回避行為(F_((4,95))=13.66,F_((4,95))=9.211,),聯(lián)合學(xué)習(xí)組表現(xiàn)出顯著回避行為并且與氣味暴露組存在差異。2.海馬齒狀回區(qū)細(xì)胞增殖水平:對(duì)PN7大鼠的增殖水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn)(F_((4,45))=38.432),PN7大鼠中聯(lián)合學(xué)習(xí)組較LiCl組具有更高的細(xì)胞增長(zhǎng)比,氣味暴露組較對(duì)照組表現(xiàn)出更高的細(xì)胞增殖,但增殖水平不及LiC組。PN24各組大鼠在短期內(nèi)細(xì)胞增殖水平差異不顯著(F_((4,45))=0.561)。3.PN7大鼠海馬齒狀回區(qū)內(nèi)神經(jīng)元增殖水平:對(duì)PN7大鼠海馬內(nèi)β3 tubulin增殖表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn)(F_((4,45))=270.191),聯(lián)合學(xué)習(xí)組的新生神經(jīng)元的增長(zhǎng)比較對(duì)照組更高,香草醛氣味暴露組也較對(duì)照組表現(xiàn)出更高的增長(zhǎng)。聯(lián)合學(xué)習(xí)組也較氣味暴露組表現(xiàn)出更高的神經(jīng)元增長(zhǎng)比。4.蛋白印記檢測(cè)c-Fos表達(dá):對(duì)PN7(F_((4.45))=184.313)和PN24(F_((4,45))=187.647)大鼠海馬內(nèi)c-Fos含量統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn),PN7和PN24大鼠在聯(lián)合學(xué)習(xí)組中表現(xiàn)出較對(duì)照組更高的蛋白表達(dá)。PN7和PN24大鼠中,氣味暴露組較聯(lián)合學(xué)習(xí)組有更高的蛋白表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.蛋白印跡檢測(cè)GAP-43表達(dá):在各組PN7大鼠中,GAP-43均具有較高的表達(dá)(F_((4,45))=21.454),氣味暴露組和聯(lián)合學(xué)習(xí)組均表現(xiàn)出較對(duì)照組更高的表達(dá)。對(duì)PN24大鼠海馬內(nèi)GAP-43蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析可見(jiàn)(F_((4.45))=524.942),氣味暴露組和聯(lián)合學(xué)習(xí)組較對(duì)照組表現(xiàn)出更高的蛋白表達(dá),聯(lián)合學(xué)習(xí)組的蛋白均高于氣味暴露組,香草醛氣味暴露下的GAP-43表達(dá)較乙醇?xì)馕侗┞断碌牡鞍妆磉_(dá)更高。第二部分微壓香氧對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)及生長(zhǎng)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響方法采用Longa改良線栓法法制備短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型。假手術(shù)組大鼠僅接受CCA、ECA結(jié)扎。完成tMCAO模型的大鼠隨機(jī)分為模型組(術(shù)后1d和7d組)、微高壓氧組(術(shù)后1d和7d組)、假手術(shù)組。MCAO大鼠各組接受Longa評(píng)估以篩選符合要求的大鼠并分組,對(duì)不同組大鼠進(jìn)行腦缺血再灌注的對(duì)大鼠進(jìn)行TTC染色觀察各組大鼠腦缺血狀況,為了解大鼠各組神經(jīng)功能恢復(fù)狀況采用免疫印跡檢測(cè)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43的表達(dá)變化。結(jié)果Longa行為評(píng)估:Longa評(píng)分主要用于評(píng)價(jià)個(gè)體神經(jīng)功能水平。單因素方差分析顯示,微高壓氧1d組較模型1d組評(píng)分較優(yōu)(F_((3,36))=7.005,P0.05)。微高壓氧7d組評(píng)分低于模型7d組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7d組與1d組比較后未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。模型組和微高壓氧組間在1d組(P0.05)和7d組(P0.05)中均存在行為學(xué)評(píng)分差異,但隨著時(shí)間的增加,差異減少。平衡木評(píng)分結(jié)果:平衡木實(shí)驗(yàn)多用于檢測(cè)術(shù)后感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況。模型1d組評(píng)分低于微高壓氧1d組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F_((3,36))=13.079,P0.05)。微高壓氧7d組評(píng)分較模型7d組評(píng)分更高(P0.05)。7d組在平衡木中的得分均較1d組的分?jǐn)?shù)更高(P0.05;P0.05)TTC染色:根據(jù)TTC染色結(jié)果可見(jiàn),除假手術(shù)組無(wú)梗死灶(全部紅染)外,其他各組均可見(jiàn)不同程度的蒼白色梗死灶。模型1d組梗死灶累及海馬區(qū)且梗死面積較微高壓氧1d組大。模型7d組較微高壓氧7d組梗死跨度更大。對(duì)梗死面積百分比統(tǒng)計(jì)可見(jiàn),7d組均較1d組個(gè)體梗死面積比更小(F_((3,16))=10.57,P0.05,P0.05)。微壓氧干預(yù)組的梗死面積比低于模型組梗死面積比(P0.05,P0.05)。GAP-43蛋白印跡檢測(cè):假手術(shù)組的GAP-43顯著低于各模型組和微高壓氧組(F_((4,20))=46.959,P0.05;P0.05;P0.05;P0.05)�；叶戎捣治隹梢钥闯�,1d的微高壓氧組GAP-43表達(dá)較模型組顯著提高(P0.05),7d組中微高壓氧組的GAP-43含量也較模型組有所提升(P0.05)。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠海馬內(nèi)GAP-43蛋白量分析發(fā)現(xiàn),7d組均表現(xiàn)出較1d組更高的GAP43蛋白表達(dá)(P0.05,P0.05)。結(jié)論1.這些結(jié)果提示氣味厭惡學(xué)習(xí)促進(jìn)PN7大鼠海馬的細(xì)胞增殖,對(duì)PN7和PN24大鼠和軸突發(fā)育可塑性均具有一定作用�？赡軐�(duì)早期發(fā)育障礙大鼠在海馬的生理和功能上具有修復(fù)作用。2.微高壓氧干預(yù)有助于延長(zhǎng)MCAO干預(yù)時(shí)間窗,幫助神經(jīng)功能恢復(fù)并提升海馬缺血處GAP43的蛋白表達(dá)以促進(jìn)海馬軸突再生。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R743;R-332
【圖文】：

圖 2 PN7 各組大鼠海馬 DG 區(qū)細(xì)胞增殖水平如圖所示，BrdU 以紅色標(biāo)記，DAPI 以藍(lán)色標(biāo)記。**P<0.01，***P<0.001 表示同一年齡下各組和 LiCl 組間比較； &&表示 P<0.0 同一氣味物質(zhì)不同學(xué)習(xí)方式之間比較。Li: LiCl 組；S+E: 生理鹽水+乙醇；S+V: 生理鹽水+香草醛；L+E: LiCl+乙醇；L+V: LiCl+香草醛PN24 大鼠的 DG 區(qū)細(xì)胞密度顯著低于 PN7 大鼠，齒狀回形態(tài)和細(xì)胞數(shù)量較為接近成年大鼠，條件學(xué)習(xí)后各組細(xì)胞增殖變化較小（F（4，45）=0.561），未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不同氣味和學(xué)習(xí)方式間未見(jiàn)顯著差異。

圖 3 PN24 各組大鼠海馬 DG 區(qū)細(xì)胞增殖水平如圖所示，BrdU 以紅色標(biāo)記，DAPI 以藍(lán)色標(biāo)記。Li: LiCl 組；S+E: 生理鹽水+乙醇；S+V: 生理鹽水+香草醛；L+E: LiCl+乙醇；L+V: LiCl+香草醛。3.2.2 PN7 大鼠海馬齒狀回神經(jīng)元細(xì)胞增殖用 β3 tubulin 對(duì)增殖細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步探索后可見(jiàn)，PN7 大鼠在齒狀回具有較高的新生神經(jīng)元表達(dá)（F（4，45）=270.191），采用 Turkey 法對(duì)各組進(jìn)行兩兩討論分析可見(jiàn)，LiCl+乙醇組和 LiCl+香草醛組的新增神經(jīng)元比 Li 組更高（分別：P<0.001,P<0.001）。生理鹽水+香草醛組也較 LiCl 組有更高的神經(jīng)元增殖比(P<0.01)。不同學(xué)習(xí)方式對(duì)神經(jīng)元增殖比具有影響，氣味聯(lián)合學(xué)習(xí)后 DG 區(qū)的早期神經(jīng)元細(xì)胞比較更高（分別為：P<0.001,P<0.001），但不同氣味物質(zhì)對(duì)早期神經(jīng)細(xì)胞增值比的影響不大。

圖 4 PN24 各組大鼠海馬 DG 區(qū)神經(jīng)元增殖水平如圖所示，BrdU 以紅色標(biāo)記，β3 tubulin 以綠色顏色表示。Li: LiCl 組；S+E: 生理鹽水+乙醇；S+V: 生理鹽水+香草醛；L+E: LiCl+乙醇；L+V: LiCl+香草醛。**P<0.01，***P<0.001 表示同一年齡下各組和 LiCl 組間比較； && P<0.01 表示同一氣味物質(zhì)不同學(xué)習(xí)方式之間比較。3.3 神經(jīng)元活動(dòng)和突觸發(fā)育相關(guān)蛋白變化3.3.1 即早基因 c-fos 在各組中的表現(xiàn)

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本文編號(hào)：2794790