【摘要】：目的流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康,接種流感疫苗仍是現(xiàn)階段預(yù)防流感最有效的措施�，F(xiàn)用流感疫苗多為滅活疫苗,其副反應(yīng)多且免疫原性差,為提高疫苗的安全性及免疫原性,本研究選擇DDA陽(yáng)離子脂質(zhì)作為疫苗佐劑,構(gòu)建DDA復(fù)合物脂質(zhì)體流感疫苗,以期通過(guò)鼻黏膜免疫獲得較高的免疫效力,從而有效預(yù)防流感,為新型疫苗及其佐劑的開(kāi)發(fā)提供有價(jià)值的參考。方法1以DDA陽(yáng)離子脂質(zhì)作為脂質(zhì)膜的主要成分,以中性磷脂DSPC作為輔助脂質(zhì),TPGS及PEG作為免疫調(diào)節(jié)劑,通過(guò)薄膜分散法制備DDA-DSPC、DDA-DSPC-TPGS和DDA-DSPC-PEG脂質(zhì)體并包載流感抗原,考察粒徑、Zeta電位、包封率(EE)、載藥量(LE)等重要指標(biāo),對(duì)所制備的各脂質(zhì)體流感疫苗進(jìn)行特性評(píng)價(jià)。并通過(guò)篩選凍干保護(hù)劑及凍干條件,對(duì)脂質(zhì)體流感疫苗的凍干處方及工藝進(jìn)行初步探索。2體外培養(yǎng)小鼠骨髓樹(shù)突狀細(xì)胞(BMDCs),通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)考察DDA陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物對(duì)樹(shù)突細(xì)胞的毒性,通過(guò)流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer,FCM)考察未成熟BMDCs對(duì)包載熒光標(biāo)記蛋白的不同脂質(zhì)體的攝取情況,評(píng)價(jià)不同脂質(zhì)體與抗原提呈細(xì)胞(APCs)相互作用并呈遞抗原的能力。并以MHCII、CD80、CD86為指標(biāo),考察各組脂質(zhì)體流感疫苗刺激DC2.4細(xì)胞分化成熟的能力。3以C57BL/6小鼠為動(dòng)物模型,通過(guò)鼻黏膜免疫,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)小鼠黏液分泌型IgA(sIgA)、血清IgG1及小鼠脾臟細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的表達(dá)水平,對(duì)DDA復(fù)合物脂質(zhì)體流感疫苗的免疫效應(yīng)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。結(jié)果1采用薄膜分散法制備的脂質(zhì)體流感疫苗,分散介質(zhì)為pH7.4的Tris-buffer,所得DDA-DSPC脂質(zhì)體流感疫苗粒徑685.0±17.8 nm,PDI 0.522±0.342,zeta電位25.4±1.9 mV,EE 65.7±2.0%,LE 6.2±0.2%;DDA-DSPC-TPGS脂質(zhì)體流感疫苗粒徑337.3±2.4 nm,PDI0.555±0.061,zeta電位15.4±2.1 mV,EE 78.5±1.5%,LE 4.2±0.2%;DDA-DSPC-PEG脂質(zhì)體流感疫苗的粒徑591.4±19.3 nm,PDI 0.470±0.023,zeta電位6.9±0.8 mV,EE 45.8±3.0%,LE 3.0±0.3%。透射電鏡觀察,以上各組脂質(zhì)體疫苗外觀均呈圓球形或橢球形。此外,通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體疫苗進(jìn)行凍干處方及工藝的考察,優(yōu)化得到脂質(zhì)體疫苗凍干的最佳處方為5%的蔗糖和5%的乳糖按質(zhì)量比1:1合用,凍干條件為預(yù)凍溫度-80℃,預(yù)凍時(shí)間8 h,在此條件下脂質(zhì)體疫苗凍干效果比較良好。2體外攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示未成熟的BMDCs和DC2.4與包載FITC-BSA的各組脂質(zhì)體孵育2小時(shí)后,DDA-DSPC脂質(zhì)體組攝取率最高,與其他各組相比,有極顯著性差異(p0.01)。游離抗原FITC-BSA組攝取率最低,其他兩組DDA-DSPC-TPGS和DDA-DSPC-PEG組攝取率低于DDA-DSPC組,但與抗原組相比,均有一定程度的提高。DCs細(xì)胞成熟實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組DDA復(fù)合物脂質(zhì)體均能顯著上調(diào)DCs表面共刺激分子CD86及MHC-II的表達(dá)水平(p0.05),表明DDA復(fù)合物脂質(zhì)體能夠促進(jìn)DCs的分化成熟。3 DDA-DSPC組脂質(zhì)體流感疫苗經(jīng)鼻黏膜免疫后,可顯著提高鼻黏液中IgA抗體滴度,DDA-DSPC-TPGS組脂質(zhì)體流感疫苗可顯著提高血清IgG1及小鼠脾臟細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)水平(p0.05),但各組脂質(zhì)體流感疫苗均未有效誘導(dǎo)IL-4的表達(dá)。結(jié)論采用薄膜分散法制備了包封率較高的DDA復(fù)合物脂質(zhì)體流感疫苗,外觀呈圓球形或橢球形,并對(duì)其凍干處方及工藝進(jìn)行了初步考察。體外攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DDA復(fù)合物脂質(zhì)體能夠提高DCs對(duì)其的攝取,尤其是DDA-DSPC組,其攝取效果明顯高于其他兩組。DCs成熟實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,和抗原組相比,DDA復(fù)合物脂質(zhì)體能夠上調(diào)DCs表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-II的表達(dá)水平,表明DDA復(fù)合物脂質(zhì)體能夠刺激誘導(dǎo)DCs分化成熟。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,三組DDA復(fù)合物脂質(zhì)體流感疫苗經(jīng)鼻黏膜免疫后,能夠誘導(dǎo)較高水平的血清IgG1抗體、鼻黏液IgA抗體及IFN-γ,體現(xiàn)了DDA復(fù)合物脂質(zhì)體良好的佐劑特性,尤其是DDA-DSPC-TPGS組脂質(zhì)體流感疫苗,其誘導(dǎo)的小鼠血清IgG1及脾細(xì)胞分泌上清中IFN-γ的表達(dá)水平高于其他各組,表明TPGS具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【圖文】：

圖 1 蛋白含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of the concentration of protein.量的測(cè)定稀釋抗原原液及待測(cè)樣品上清液，根據(jù) BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)

2 脂質(zhì)體流感疫苗的 TEM 圖 a) DDA-DSPC 脂質(zhì)體流感疫苗，b) DDA-DSPC-TPGS質(zhì)體流感疫苗，c) DDA-DSPC-PEG 脂質(zhì)體流感疫苗gure 2 TEM of a) DDA-DSPC liposomes influenza vaccines，b) DDA-DSPC-TPGS liposinfluenza vaccines and c) DDA-DSPC-PEG liposomes influenza vaccines

圖 1 第 7 天樹(shù)突狀細(xì)胞倒置顯微鏡觀察（a：10 倍鏡；b：40 倍鏡）ure 1 The cultured cells showed dendritic structure under inverted microscope at the 7thd10×; b: 40×）BMDCs 表面 CD11c 的表達(dá)結(jié)果

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本文編號(hào)：2793716