【摘要】：非洲睡眠病是世界衛(wèi)生組織重點(diǎn)監(jiān)控的六大熱帶病之一,若不及時(shí)治療,將致患者死亡。該病現(xiàn)主要流行于非洲36國,但伴隨商貿(mào)和旅游業(yè)的發(fā)展,我國于2015-2017年亦出現(xiàn)三例輸入性病例。布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)是引起非洲睡眠病的主要病原體,也是重要的研究模式病原生物。布氏錐蟲細(xì)胞與哺乳動(dòng)物細(xì)胞有諸多差異,布氏錐蟲具有稱之為“基體”的成對(duì)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器,其主要由一個(gè)成熟的基體和一個(gè)原基體組成,與哺乳動(dòng)物的中心體同源,具有參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和鞭毛合成的作用。基體是由上百個(gè)蛋白組成,但迄今仍有眾多組成蛋白未被鑒定。本實(shí)驗(yàn)室前期鑒定出的基體候選蛋白BBP1,在布氏錐蟲的細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用,但其具體功能還未被解析。本論文仔細(xì)研究了BBP1的胞內(nèi)定位并闡明其分子水平上的生物學(xué)功能。首先,通過原核表達(dá)BBP1的特異多肽(Glu2-Glu400)并免疫新西蘭兔,成功獲得兔源抗血清。靈敏度檢測結(jié)果顯示,該抗血清對(duì)蛋白多肽的滴度為1:5×10~6,對(duì)全蟲抗原滴度達(dá)到1:10~5,并且能夠應(yīng)用于免疫熒光手段,特異性標(biāo)記目標(biāo)蛋白�？寡迕庖邿晒鈽�(biāo)記及YFP融合蛋白實(shí)驗(yàn)顯示,錐蟲細(xì)胞中BBP1蛋白信號(hào)僅出現(xiàn)于成熟基體,直至核G2期在新生原基體處也出現(xiàn)信號(hào)。其次,為了研究BBP1在布氏錐蟲中的調(diào)控功能,構(gòu)建了BBP1 RNA干擾蟲株,結(jié)果顯示BBP1干擾48小時(shí)后,錐蟲細(xì)胞生長明顯被抑制,細(xì)胞核型分析發(fā)現(xiàn)單個(gè)動(dòng)基體多個(gè)細(xì)胞核(1KXN,占比24.33%)的異常細(xì)胞數(shù)目增加,72小時(shí)后出現(xiàn)多動(dòng)基體多細(xì)胞核(XKXN,占比9.05%)的異常細(xì)胞,相應(yīng)的正常的1K1N、2K1N和2K2N細(xì)胞比例顯著下降(對(duì)照,97.96%;24 h,92.43%;48h,59.69%;72 h,34.22%)。通過定量分析DAPI標(biāo)記的錐蟲動(dòng)基體DNA熒光強(qiáng)度顯示,當(dāng)細(xì)胞BBP1干擾24小時(shí)后,其動(dòng)基體DNA發(fā)生不均等分裂現(xiàn)象。透射電鏡分析這類異常細(xì)胞發(fā)現(xiàn),它們的鞭毛二聚微管及中央微管發(fā)生缺失,暗示BBP1對(duì)錐蟲鞭毛微管蛋白的穩(wěn)定或裝配具有重要作用。此外,錐蟲的BBP1蛋白缺失也導(dǎo)致了細(xì)胞基體SAS6蛋白的裝配異常以及新生鞭毛從胞體脫落的異常性狀。最后,基體的一大標(biāo)志特征是具有募集酪氨酸化α-tubulin的能力,可用抗體YL1/2標(biāo)記觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾細(xì)胞中BBP1蛋白后,其定位于成熟基體處的YL1/2信號(hào)消失,但另一已知的功能相關(guān)蛋白TbRP2的定位和表達(dá)均未受到影響;而TbRP2 RNAi后BBP1的定位及酪氨酸化α-tubulin在基體的募集均受到了影響。綜上所得,實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明BBP1定位于成熟基體和原基體,裝配入原基體的時(shí)間為細(xì)胞核G2期,對(duì)原基體成熟及鞭毛發(fā)育過程中起著重要作用,并能進(jìn)一步影響動(dòng)基體分裂和胞質(zhì)分裂。而機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),BBP1的這些功能是通過影響基體募集酪氨酸化的α-tubulin而實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R382.23
【圖文】：

2圖 1-1 非洲睡眠病的流行病學(xué)分布：A）布氏錐蟲岡比亞亞種；B）布氏錐蟲羅德西亞亞種。紅色由深到淺示各國由多到少的病例數(shù)。（引自 http://gamapserver.who.int/mapLibrary/app/searchResults.aspx）。Figure 1-1 Epidemiological distribution of humanAfrican trypanosomiasis.A) T. b. gambiense; BT. b. rhodesiense. Red blocks indicating the number of infection cases in respective contries (citedfrom http://gamapserver.who.int/mapLibrary/app/searchResults.aspx).

圖 1-2 布氏錐蟲生活史。1-8 示各時(shí)期主要事件，詳見正文。（引自 CDC: https://www.cdc.gov/parasites/sleepingsickness/biology.html）Figure 1-2 Life cycle of Trypanosoma brucei. 1-8 indicates the major event(s), more detailsavailable in text. (cited from CDC: https://www.cdc.gov/parasites/sleepingsickness/biology.html1.1.2.2 布氏錐蟲的細(xì)胞結(jié)構(gòu)基 于 2012 年 真 核 生 物 的 分 類 系 統(tǒng) ， 布 氏 錐 蟲 隸 屬 于 動(dòng) 基 體 綱（Metakinetoplastina）錐蟲目（Trypanosomatida）錐蟲科（Trypanosomatidae）錐蟲屬（Trypanosoma）（Moreira et al., 2004；Adl et al., 2012）。布氏錐蟲細(xì)胞呈錐形體，兩端半徑小，中間半徑大，鞭毛自細(xì)胞中后部發(fā)出伸向前端（anterior）與細(xì)胞膜相連形成波動(dòng)膜，部分伸出體前形成游離鞭毛。胞內(nèi)具有真核生物常見的

6A）布氏錐蟲細(xì)胞模式圖（Matthews, 2005）；B）布氏錐蟲掃描電鏡圖及成式圖（Langousis & Hill, 2014）；C）鞭毛橫切面模式圖（Langousis & Hill, 2錐蟲成熟基體透射電鏡圖：1-9 為縱切面（左）對(duì)應(yīng)位置的由近端至遠(yuǎn)端的Vaughan & Gull, 2016）。-3A)Aschematic diagram of Trypanosoma brucei (Matthews, 2005). B) SEM owith schematic diagram of basal body and flagellum (Langousis & Hill, 2014). Cschematic diagram of flagellum (Langousis and Hill, 2014). D) TEM of T. bruceidy: 1-9 represent cross sections (right) from the proximal end to the distal end asng in vertical section (left) (Vaughan & Gull, 2016) .

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本文編號(hào)：2793189