發(fā)布時(shí)間：2020-08-10 19:47

【摘要】：研究背景間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有獨(dú)特的低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)作用。脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCs)具有取材方便、來源充足等優(yōu)勢,已成為MSCs領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。研究表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在炎癥微環(huán)境中高表達(dá)細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)和血管細(xì)胞間黏附分子1(VCAM-1),當(dāng)封閉這些黏附分子或者促使這些黏附分子無法表達(dá)后,BMSCs的免疫抑制能力會(huì)顯著降低。ASCs中僅高表達(dá)ICAM-1,ICAM-1是否對人ASCs的生物學(xué)特性以及免疫抑制功能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用還未見文獻(xiàn)報(bào)道。此外,干擾素-γ(IFN-y)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1 β(IL-1 β)等細(xì)胞因子是BMSCs發(fā)揮免疫抑制活性不可缺少的“授權(quán)”因子,它們都可以增強(qiáng)BMSCs的免疫抑制能力,而這些細(xì)胞因子是否通過ICAM-1影響ASCs的免疫抑制功能尚待探討。明確ICAM-1對ASCs的生物學(xué)特性及免疫抑制功能的影響,將為深入了解ASCs的免疫調(diào)節(jié)特性及臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。研究目的1.探討ICAM-1對ASCs增殖、凋亡、周期、遷移以及成脂、成骨、成軟骨分化等生物學(xué)特性的影響。2.探討ICAM-1對ASCs免疫調(diào)節(jié)功能的影響。3.探討TNF-α對ASCs中ICAM-I表達(dá)的影響及機(jī)制。4.探討適合ASCs的最佳凍存液以及低溫保存對ASCs免疫調(diào)節(jié)功能的影響。研究方法1.ICAM-1對ASCs生物學(xué)特性的影響采用膠原酶消化法從脂肪組織中獲得ASCs,倒置顯微鏡下觀察,成脂、成骨、成軟骨分化誘導(dǎo),流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面標(biāo)志物檢測。構(gòu)建ICAM-1的敲減和過表達(dá)質(zhì)粒,利用慢病毒感染的方法在ASCs中敲減和過表達(dá)ICAM-1,CCK-8法檢測ASCs增殖,Muse細(xì)胞狀態(tài)分析儀檢測細(xì)胞凋亡和周期的變化,劃線法和Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力的改變,分別使用油紅O、茜素紅和阿利新藍(lán)對成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)后的ASCs進(jìn)行染色以檢測ASCs的分化能力。2.ICAM-1對ASCs免疫調(diào)節(jié)功能的影響提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),CFSE染色后,分別按照1:10、1:20、1:40、1:80、1:160的比例接種ASCs和PBMC,顯微鏡下觀察ASCs對PBMC增殖的影響,流式檢測ASCs對PBMC增殖的影響。按照1:10的比例分別以接觸共培養(yǎng)和Transwell隔離共培養(yǎng)的方式接種ASCs和PBMC,顯微鏡下觀察ASCs對PBMC增殖的影響,流式檢測ASCs對PBMC增殖的影響。流式檢測ICAM-1敲減組(shICAM-1組)、ICAM-1敲減對照組(shScramble組)、ICAM-1過表達(dá)組(ICAM-1-OV組)和ICAM-1過表達(dá)對照組(PCDH組)ASCs對PBMC增殖的影響。3.TNF-α對ASCs中ICAM-1表達(dá)的影響以及機(jī)制體外分別添加TNF-α和IFN--γ,以及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、單核細(xì)胞超化蛋白-1(MCP-1)、IL-1 β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 等細(xì)胞因子,流式檢測 BMSCs和ASCs中VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)。采用干細(xì)胞培養(yǎng)基、L-DMEM+FBS、L-DMEM+人血清、L-DMEM+血小板裂解液、F12培養(yǎng)基+FBS五種條件進(jìn)行培養(yǎng),流式檢測不同培養(yǎng)條件下ASCs中ICAM-1的表達(dá)。干細(xì)胞培養(yǎng)基條件下對ASCs進(jìn)行傳代培養(yǎng),流式檢測P2到P9不同代數(shù)ASCs中ICAM-1的表達(dá)。采用P3代ASCs,流式檢測0.1～100ng/mL不同濃度TNF-α對ASCs中ICAM-1的表達(dá)的影響。Reαl-time PCR和流式分別檢測5ng/mL TNF-α在1h、3h、6h、12h、24h、48h時(shí)間點(diǎn)對ASCs中ICAM-1基因和蛋白表達(dá)量的影響。檢測mTOR通路抑制劑PP242和Rapamycin、JNK通路抑制劑SP600125、MEK1/2通路抑制劑U0126和NF-κB通路抑制劑 BAY11-7082對ASCs中ICAM-1表達(dá)量的影響以及TNF-α導(dǎo)致ASCs中ICAM-1表達(dá)量變化的影響。4.不同配比凍存液對ASCs生物學(xué)特性及ICAM-1的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)功能的影響分別采用不同比例的FBS和DMSO組合的凍存液凍存ASCs,然后使用Muse細(xì)胞分析儀檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活力;CCK-8法檢測凍存組以及新鮮組ASCs增殖能力;流式檢測凍存組以及新鮮組ASCs細(xì)胞表面標(biāo)志物及ICAM-1的表達(dá);油紅O、茜素紅和阿利新藍(lán)染色分別檢測凍存組以及新鮮組ASCs成脂、成骨、成軟骨分化;流式檢測95%FBS和5%DMSO凍存組和新鮮組ASCs對PBMC的體外增殖的影響。研究結(jié)果1.ICAM-1對ASCs生物學(xué)特性的影響P3代ASCs呈成纖維樣貼壁生長,CD44、CD73、CD90與CD105等MSCs表面標(biāo)志物均呈陽性表達(dá),而CD45、CD34、CDllb、CD19和HLA-DR呈陰性表達(dá),能夠向成脂、成骨、成軟骨三向分化。在培養(yǎng)第三天時(shí),shICAM-1組ASCs的增殖能力顯著高于shScramble組,而ICAM-1-OV組ASCs的增殖能力則低于PCDH組;敲減、過表達(dá)ICAM-1后的ASCs體外凋亡和細(xì)胞周期與對照組相比沒有明顯變化;劃線法結(jié)果顯示,shICAM-1組ASCs在6h、12 h和24 h細(xì)胞遷移距離明顯大于shScramble組,ICAM-1-OV組ASCs在12 h細(xì)胞遷移距離明顯小于PCDH組;Transwell法結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示,shICAM-1組ASCs在12 h和24 h細(xì)胞遷移數(shù)量明顯多于shScramble組,ICAM-1-OV組ASCs在24 h細(xì)胞遷移數(shù)量明顯低于PCDH組;油紅O、茜素紅和阿利新藍(lán)染色結(jié)果顯示敲減、過表達(dá)ICAM-1后ASCs體外成脂、成骨、成軟骨分化能力無變化。2.ICAM-1對ASCs免疫調(diào)節(jié)功能的影響倒置顯微鏡下可見,PBMC經(jīng)過PHA刺激后,呈聚集性生長增殖,而加入ASCs后PBMC聚集能力變?nèi)?ASCs比例越高,PBMC的聚集成團(tuán)能力越弱,ASCs對PBMC增殖的抑制作用與ASCs的比例成正比,ASCs與PBMC比例為1:10和1:20時(shí),與不加ASCs組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義接觸共培養(yǎng)和隔離共培養(yǎng)時(shí),ASCs都能夠抑制PBMC的增殖,但接觸共培養(yǎng)時(shí),ASCs對PBMC增殖的抑制作用更強(qiáng)。shICAM-1組ASCs對PBMC增殖的抑制作用弱于shScramble組,PCDH組ASCs對PBMC增殖的抑制作用與ICAM-OV組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.TNF-α對ASCs中ICAM-1表達(dá)的影響以及機(jī)制TNF-α和IFN-y能夠促進(jìn)BMSCs中VCAM-1和ICAM-1的表達(dá),但僅能促進(jìn)ASCs中ICAM-1的表達(dá)。促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-1 β能夠促進(jìn)ASCs中ICAM-1的表達(dá),IL-6、IL-8、MCP-1等促炎因子以及TGF-β1、IL-10、IL-13等抑炎因子則對ASCs中ICAM-1的表達(dá)無影響。干細(xì)胞培養(yǎng)基組、L-DMEM+FBS組、F12培養(yǎng)基+FBS組、L-DMEM+血小板裂解液組培養(yǎng)的ASCs中ICAM-1為低表達(dá),而L-DMEM+人血清培養(yǎng)的ASCs中ICAM-1為中表達(dá)。隨著傳代次數(shù)的增加,ASCs中ICAM-1的表達(dá)也逐漸升高。ASCs 分別經(jīng)過 0.lng/mL、0.5ng/mL、Ing/mL、5ng/mL、10ng/mL 的 TNF-α 刺激后,ICAM-1的表達(dá)也是逐漸升高,而從lOng/mL的濃度開始,20ng/mL、40ng/mL、60ng/mL、100ng/mL的TNF-α對ASCs中ICAM-1的表達(dá)變化影響不再明顯。流式結(jié)果顯示,5ng/mL的TNF-α刺激ASCs后3h,ICAM-1表面蛋白表達(dá)開始升高,持續(xù)到48h。Real-time PCR結(jié)果顯示,ASCs分別經(jīng)過5ng/mL的TNF-α刺激lh后,ICAM-1基因的表達(dá)即開始升高,6h后逐漸下降。TNF-α主要通過NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)ASCs中ICAM-1的表達(dá),而mTOR通路、JNK通路以及MEK1/2通路對TNF-α引起的ASCs中ICAM-1的表達(dá)無明顯影響。4.低溫保存對ASCs生物學(xué)特性及ICAM-1的表達(dá)和免疫調(diào)節(jié)功能的影響凍存保護(hù)劑中,隨著DMSO濃度的增加,ASCs的活力提高,90%FBS和10%DMSO組,95%FBS和5%DMSO組的細(xì)胞存活率相似。90%FBS和10%DMSO組,95%FBS和5%DMSO組低溫保存的ASCs顯示出與新鮮ASCs相似的增殖速率、細(xì)胞表面標(biāo)志和分化能力。95%FBS和5%DMSO凍存組ASCs和新鮮組ASCs在抑制PBMC增殖方面沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)論1.敲減ICAM-1促進(jìn)ASCs的增殖和遷移,過表達(dá)ICAM-1抑制ASCs的增殖和遷移,但敲減和過表達(dá)ICAM-1對ASCs凋亡、周期和分化無影響。2.ASCs對PBMC有免疫抑制作用,ASCs與PBMC接觸共培養(yǎng)時(shí),ASCs對PBMC增殖的抑制作用更強(qiáng),敲減ICAM-1后ASCs對PBMC的免疫抑制能力降低。3.ASCs在不同的培養(yǎng)條件以及不同的代數(shù)時(shí),ICAM-1的表達(dá)不同;TNF-α和IFN-γ能夠促進(jìn)BMSCs中ICAM-1和VCAM-1的表達(dá),TNF-α、IFN-γ和IL-1 β能夠促進(jìn)ASCs中ICAM-1的表達(dá);ASCs中ICAM-1的表達(dá)隨著培養(yǎng)條件中TNF-α濃度的增加而升高,在達(dá)到10ng/mL及以上濃度時(shí),ICAM-1的表達(dá)變化不再明顯;TNF-α主要通過NF-κB信號通路來調(diào)節(jié)ASCs中ICAM-1的表達(dá)。4.低溫保存能夠維持ASCs的活性、增殖能力、表面標(biāo)志、分化及免疫調(diào)節(jié)潛能;95%FBS和5%DMSO組合是ASCs低溫保存的理想凍存保護(hù)劑。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院邐博上研宄生學(xué)位論文逡逑（２）成脂、成骨、成軟骨分化實(shí)驗(yàn)具體步驟同前，略。逡逑三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑１．敲減／過表達(dá)ＩＣＡＭ－１后的ＡＳＣｓ體外增殖能力的變化逡逑應(yīng)用ＣＣＫ－８法檢測ＩＣＡＭ－１敲減和過表達(dá)后ＡＳＣｓ的增殖情況，并繪制出ＤａｙＯ、逡逑Ｄａｙｌ、Ｄａｙ３、Ｄａｙ５、Ｄａｙ７天細(xì)胞增殖柱狀圖。如圖１．２．丨所示，各組ＡＳＣｓ均在逡逑Ｄａｙｌ－Ｄａｙ３天處于對數(shù)增長期，Ｄａｙ５－Ｄａｙ７天逐漸進(jìn)入平臺期。在Ｄａｙ３天時(shí)，敲減逡逑組ＡＳＣｓ（ｓｈＩＣＡＭ－ｌ邋）的增殖能力顯著高于對照組（ｓｈＳｃｒａｍｂｌｅ），而過表達(dá)組（ＩＣＡＭ－逡逑１－ＯＶ）的增殖能力顯著低于對照組（ＰＣＤＨ），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院邐ｗN－研究生學(xué)位論文逡逑（４）用１００吣的１６４０培養(yǎng)基培養(yǎng)，在含５％邋ＣＯ２、３７°Ｃ的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)５ｄ；逡逑（５）流式細(xì)胞儀檢測ＡＳＣｓ對ＰＢＭＣ增殖的影響。逡逑三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑１．邋ＡＳＣｓ對ＰＢＭＣ的增殖具有抑制作用逡逑倒置顯微鏡下可見，ＰＢＭＣ經(jīng)過ＰＨＡ刺激后，呈聚集性生長增殖，而加入ＡＳＣｓ逡逑后ＰＢＭＣ聚集能力變?nèi)�，ＡＳＣｓ比例越高，ＰＢＭＣ的聚集成團(tuán)能力越弱（圖１．３．１）。逡逑流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，不加ＡＳＣｓ組的ＰＢＭＣ細(xì)胞增殖率為７８．６７±邋５．７７％，而ＡＳＣｓ逡逑與ＰＢＭＣ比例為１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０時(shí)，ＰＢＭＣ細(xì)胞的增值率分別為逡逑４６．００±７．５６％、５５．０３±６．２４％、７３．６±３．１６％、８３．０３±３．１５％、７２．６±８．３６％，結(jié)果表逡逑明ＡＳＣｓ對ＰＢＭＣ增殖的抑制作用與ＡＳＣｓ的比例成正比，ＡＳＣｓ與ＰＢＭＣ比例為逡逑１：１０和１：２０時(shí)，與不加ＡＳＣｓ組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖１．３．２）。逡逑ＰＢＭＣ＋ＰＨＡ邐ＡＳＣｓ＋ＰＢＭＣ＋ＰＨＡ邋（１：１０）逡逑

圖丨．３．２流式檢測ＡＳＣｓ對ＰＢＭＣ增殖的抑制作用逡逑Ａ．流式細(xì)胞儀檢測不同比例的ＡＳＣｓ與ＰＢＭＣ共培養(yǎng)后，ＰＢＭＣ的增殖變化Ｂ．ＰＢＭＣ增殖統(tǒng)逡逑計(jì)分析（＊＊ｐ＜０．０１，邋＊＊＊／＞＜0．00１）逡逑２．邋ＡＳＣｓ與ＰＢＭＣ接觸共培養(yǎng)和隔離共培養(yǎng)都能夠抑制ＰＢＭＣ的增殖逡逑倒]顯微鏡下可見（圖１．３．３邋Ａ），邋ＰＢＭＣ經(jīng)過ＰＨＡ刺激后，呈明顯的聚集性成逡逑團(tuán)〔長，ＰＢＭＣ與ＡＳＣｓ接觸兆培養(yǎng)時(shí)，ＰＢＭＣ的聚集成團(tuán)能力變?nèi)�，使用Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ逡逑小室將ＰＢＭＣ和ＡＳＣｓ隔離共培養(yǎng)時(shí)，ＰＢＭＣ的聚集成團(tuán)能力強(qiáng)于接觸共培養(yǎng)，似逡逑５３逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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1 王艷國;趙岳;李喜梅;唐博;褚亞男;劉元林;朱恒;張毅;;細(xì)胞間粘附分子-1在小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞體外遷移中的作用及其機(jī)制[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2014年02期

2 陳繼德;徐芬芬;朱恒;李喜梅;唐博;劉元林;張毅;;細(xì)胞間黏附分子1通過活化MAPK通路調(diào)節(jié)小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化[J];中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2014年01期

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本文編號：2788527