【摘要】：假病毒檢測技術(shù)在病毒疫苗評價(jià)及抗病毒藥物研究中應(yīng)用廣泛，其中最具代表性的是HPV及HIV的假病毒檢測技術(shù)，但現(xiàn)有技術(shù)還存在許多缺陷，特別是檢測通量較低，難以應(yīng)用于大規(guī)模的疫苗臨床評價(jià)和血清流行病學(xué)調(diào)查，而且對于HIV耐藥分析中的弱勢株檢出率較低。本研究基于上述問題，建立了兩種高通量的HPV假病毒檢測技術(shù)和一種HIV假病毒檢測技術(shù)，并在中和抗體及耐藥性檢測方面進(jìn)行了應(yīng)用。 通過報(bào)告基因篩選及引入新的結(jié)果判讀技術(shù)，建立了兩種高通量HPV中和抗體評價(jià)方法，并對影響檢測的各種因素進(jìn)行了優(yōu)化和驗(yàn)證。利用建立的方法檢測50份疫苗免疫血清樣本，發(fā)現(xiàn)HPV疫苗免疫產(chǎn)生的高滴度中和抗體對親緣關(guān)系較近型別的病毒具有一定的交叉保護(hù)作用；在對HPV自然感染人群樣本檢測中發(fā)現(xiàn)，相同亞屬病毒的中和抗體有共同出現(xiàn)的趨勢，出現(xiàn)該趨勢的原因不是抗體的交叉保護(hù)，而是不同型別病毒先后感染相同個(gè)體引起的。中和抗體檢測結(jié)果與細(xì)胞學(xué)檢測HSIL+之間無明顯的相關(guān)性。 通過HIV-1骨架載體改造，提高了假病毒構(gòu)建效率和耐藥性檢測效率。在耐藥性樣本檢測中，發(fā)現(xiàn)了與蛋白酶抑制劑NFV相關(guān)的兩個(gè)耐藥性突變位點(diǎn)K20R和I72M，與核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑AZT相關(guān)的兩個(gè)耐藥性位點(diǎn)T69I和F130S。在b12中和抗體表位分析中，發(fā)現(xiàn)了病毒膜蛋白上三個(gè)影響中和抗體b12敏感性的氨基酸位點(diǎn)，分別為V2區(qū)的V182L，C2區(qū)的N276S，C3區(qū)的R346S。 本研究中建立的三種方法，極大地提高了檢測通量，能基本滿足現(xiàn)有的檢測需求，在HPV臨床樣本檢測、HIV耐藥性分析及HIV中和抗體表位分析等方面具有較好的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392.11
【圖文】：

圖 1.1 高通量 HPV 假病毒檢Figure 1.1 Establishment and application ofplatform 2. 高通量 HIV 假病毒檢測體系的隨著 HAART 療法的普遍應(yīng)用，耐藥的上升的趨勢，耐藥 HIV 病毒株的出現(xiàn)也是新耐藥位點(diǎn)的出現(xiàn)和多位點(diǎn)聯(lián)合耐藥病藥性檢測技術(shù)的應(yīng)用都提出了很大的挑耐藥性檢測方法，對于新出現(xiàn)的耐藥位點(diǎn)的高通量包括兩個(gè)方面，一是病毒構(gòu)建的疫人群樣本檢測 自然感染人群樣本

Gluc載體、Fluc基因、Seap基因及Nanoluc基因（引物見表2.1），用in技術(shù)分別將載體與Fluc、Seap、Nanoluc擴(kuò)增片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后進(jìn)行序列測定，將序列比對無誤的質(zhì)粒連同pCMV-Gluc2質(zhì)粒進(jìn)行大提取。A B C D

將上述四種報(bào)告基因質(zhì)粒的濃度統(tǒng)一調(diào)至1 μg/μl，與HPV16 L1/L2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞293FT，制備包裝有不同報(bào)告基因的HPV16假病毒。將上述四種假病毒分別系列稀釋后接種293FT細(xì)胞，培養(yǎng)72小時(shí)后，分別加入對應(yīng)的檢測底物，檢測不同稀釋度對應(yīng)的化學(xué)發(fā)光值RLU（relative light unit），以稀釋倍數(shù)的對數(shù)值作橫坐標(biāo)，以化學(xué)發(fā)光值的對數(shù)值作縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖并做線性回歸，Seap、Gluc和Nanoluc假病毒對應(yīng)的線性相關(guān)系數(shù)R2都在0.99以上（圖 2.1）。同時(shí)，以不同報(bào)告基因假病毒稀釋1600倍的RLU值和未加假病毒的細(xì)胞對照的RLU值做柱狀圖（圖 2.2.），發(fā)現(xiàn)未加假病毒的細(xì)胞對照（即實(shí)驗(yàn)檢測本底）Seap >Fluc >Gluc >Nanoluc，相同稀釋度下病毒檢測值與細(xì)胞對照的比值可以反映假病毒的滴度，四種假病毒滴度依次為Nanoluc >Gluc >Seap >Fluc，根據(jù)線性相關(guān)系數(shù)、實(shí)驗(yàn)檢測本底以及病毒滴度的結(jié)果，初步選定Nanoluc和Gluc作為候選報(bào)告基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 種輝輝;許四宏;王佑春;;評價(jià)HIV-1抗病毒藥物的重組假病毒法的建立及其初步應(yīng)用[J];藥物分析雜志;2008年06期

本文編號：2788212