發(fā)布時間：2020-08-10 07:29

【摘要】：病毒樣顆粒(virus-like particle)是含有某種病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白,但不包含核酸的自組裝顆粒,其形態(tài)與真正病毒粒子相同或相似,可作為疫苗的抗原成分。乙肝表面抗原(HBsAg)是一種重要的病毒樣顆粒,可以通過注射來使機體產(chǎn)生抗體,達到免疫和阻斷乙肝傳播的目的。在HBsAg的生產(chǎn)和流通過程中,需要面對許多苛刻的環(huán)境因素,比如鹽濃度、溫度變化,反復凍融等,這些環(huán)境因素可能會導致HBsAg出現(xiàn)聚集失活現(xiàn)象,從而影響了疫苗的安全性和有效性。但遺憾的是,目前尚無系統(tǒng)的乙肝疫苗穩(wěn)定性研究報道。在本文中,我們首次采用無填充介質(zhì)的非對稱垂直流場流分級技術(shù)偶聯(lián)多角度激光散射技術(shù)(AF4-MALLS)應用于乙肝疫苗病毒樣顆粒的表征,并對兩種常見的乙肝疫苗產(chǎn)品(分別由中國倉鼠卵CHO細胞和漢遜酵母細胞表達)在其純化、生產(chǎn)、運輸以及儲存過程中所經(jīng)歷的不同環(huán)境條件下的顆粒穩(wěn)定性進行了研究,主要內(nèi)容包括：1)優(yōu)化得到了適于分離HBsAg及其聚集體的場流分級條件：①進樣和聚焦階段：進樣流速0.2 ml/min,聚焦流速1.8 ml/min,外場流速1.0 ml/min,時間4 min,聚焦階段和分級階段的過渡時間是1 min,腔室出口流速保持1.0 ml/min恒定；②分級階段：外場流速1.0 ml/min保持40 min,然后在5 min內(nèi)線性衰減到0；③再生階段：腔室流速1ml/min,保持5min。間隔物厚度350 μm,分離膜為再生纖維素膜,截留分子量為10 kDa。采用AF4-MALLS表征得到中國倉鼠卵CHO細胞表達的CHO-HBsAg和漢遜酵母細胞表達的Hans-HBsAg的重均分子量分別為4742 kDa和3039 kDa；水力學半徑分別為29.4 nm和22.8nm。2)通過AF4-MALLS對CHO-HBsAg和Hans-HBsAg在不同溶液環(huán)境下的聚集行為進行了研究,并使用抗原診斷試劑盒檢測了相應的抗原活性。在2M硫酸銨條件下,CHO-HBsAg比較穩(wěn)定,活性保持在95%,而Hans-HBsAg明顯發(fā)生聚集形成分子量105-106 kDa的聚集體,其活性僅保留25%；在反復凍融操作之后,CHO-HBsAg的結(jié)構(gòu)和活性幾乎沒有什么變化,而Hans-HBsAg發(fā)生了明顯的聚集,活性僅剩余26.9%：在高溫(60℃)處理之后,CHO-HBsAg依然穩(wěn)定,而Hans-HBsAg的活性已經(jīng)不足5%。3)系統(tǒng)考察了氯化鈉和硫酸銨對Hans-HBsAg穩(wěn)定性的影響,并對Hans-HBsAg在鹽溶液中的聚集行為進行了分析,在此基礎上建立了Hans-HBsAg在鹽溶液中的聚集模型。Hans-HBsAg在NaCl溶液中發(fā)生可逆聚集形成寡聚體(OP),伴隨著生物活性的輕微損失。通過透析除去NaCl之后,寡聚體可重新解聚為正常組裝體,同時抗原活性隨之恢復。在硫酸銨溶液中的聚集情況較為復雜,當硫酸銨濃度較低(0.5M)且作用時間較短時(1h),大部分HBsAg聚集成寡聚體形式,當硫酸銨去除后,寡聚體可以重新解聚;而高濃度硫酸銨條件下,OP會進一步聚集形成高聚體(PP), PP的尺寸很大,且該聚集過程會導致抗原活性大幅度降低。即使通過透析去除硫酸銨,也無法使得PP重新解聚成正常組裝體,抗原活性也無法恢復。4)考察了幾種常見的小分子添加劑對Hans-HBsAg穩(wěn)定性以及抗原活性的影響。脲和鹽酸胍對乙肝疫苗聚集沒有明顯抑制作用,相反它們作為變性劑,可使蛋白發(fā)生聚集；精氨酸對乙肝聚集方面發(fā)揮了比較明顯的抑制作用,精氨酸對乙肝疫苗聚集的抑制效果與其濃度相關(guān),當精氨酸濃度達到1M時,抑制效果較好；聚乙二醇對乙肝疫苗的抗原活性似乎沒有明顯影響。而表面活性劑對乙肝疫苗抗原活性的影響表現(xiàn)出不同的效果,吐溫80可以提高乙肝疫苗的活性,而Triton100則會使乙肝疫苗的活性降低。
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(過程工程研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392;TQ464
【圖文】：

３０邐非對稱垂直流場流分級技術(shù)應用于病毒樣顆巧穩(wěn)定性的研巧與調(diào)節(jié)功能。不同的生物膜膽固醇的含量在２５％到５０％么間。膽固醇在踞脂雙逡逑層上的最大溶解度為６６％，超過此濃度將導致膽固醇變成晶體狀。鑒于膽固醇逡逑的重要作用，大多數(shù)在體外的生物膜模擬研究時都會包含膽固醇。當脂質(zhì)分散逡逑于水性溶液中時，由于分子具有極性導致聚集的發(fā)生，疏水鏈包在內(nèi)側(cè)，親水逡逑的極性頭指向外側(cè)。聚集的形式取決于分子結(jié)構(gòu)、濃度Ｗ及周圍溶液環(huán)境諸如逡逑溫度、離子強度＾＾義溶劑姐成等等。典型的－種是脂質(zhì)小巧泡，俗稱脂質(zhì)體，逡逑通常是大小O喗綞ǖ�，分睬v冢玻埃玻埃板澹睿矸段�，分为小巧攀n⒋笄膳藎準板義銑筧藎惴河τ糜詵治雋煊頡６嗖閬迮菘賞ü煌姆椒ㄖ魄傻ゲ闈膳藎義喜煌姆椒ɑ岬賈灤緯剎煌牡ゲ閾∨藎緋苫竦瞇∏膳藎費雇義匣竦么竽藎ㄍ跡保保擔�。辶x希恚潁睿蟈澹睿媯

本文編號：2787770