【摘要】：目的:人體的表皮干細胞,又名人類角質形成細胞(HCKs),具有高分化潛能,能夠增殖并分化出多種皮膚細胞,人們可利用此潛能進行臨床疾病的再生治療以及細胞學研究。而現(xiàn)階段提取成人表皮干細胞的方法步驟較為繁瑣,且提取的原代細胞數(shù)量有限,使其在后續(xù)的應用上受到限制。本研究旨在針對現(xiàn)階段表皮干細胞提取方法存在的不足進行改良,并探討其改良方案及改良后的提升效果。方法:將手術中切除的成人皮膚組織置于70%乙醇中30秒,清洗表面血塊等雜物,并用剪刀對組織稍加修整。放入含有2%-3%青鏈霉素的PBS緩沖液進行簡單的消毒,進一步清洗。共浸泡兩次,每次3分鐘,以達到滅菌消毒的目的。然后用手術刀將組織完全切碎成勻漿狀態(tài),將勻漿樣組織轉入50ml離心管中加入酶消化液(1g組織用20ml酶消化液,2.5mg/ml I型膠原酶和2.5mg/ml解離酶),混勻。將其放入37℃水浴鍋內震蕩消化60分鐘。再加入0.25%的胰蛋白酶(1:5)到含組織的50ml離心管中繼續(xù)消化30分鐘;最后加入DNA酶I(10mg/ml)37℃消化5分鐘。組織消化好后加相同體積的含有10%胎牛血清(FBS)的終止培養(yǎng)基反復吹打(大約20下)100μm細胞過濾器過濾,離心,棄上清,細胞沉淀用含10%胎牛血清的終止培養(yǎng)基重懸,離心;棄上清,所得的細胞沉淀用表皮培養(yǎng)基重懸,接種到細胞培養(yǎng)瓶或100mm細胞培養(yǎng)皿。培養(yǎng)皿里加入1:1000濃度為10mM的Rho關聯(lián)蛋白激酶抑制劑Y-27632,培養(yǎng)2-3天。每2-3天換液。細胞密度生長至80%時進行傳代、凍存或后續(xù)研究。同時,利用傳統(tǒng)方法對相同皮膚組織進行細胞提取與培養(yǎng):用10ml PBS沖洗,然后,用10ml 70%乙醇沖洗30秒,用10ml洗滌液(含2%青霉素和鏈霉素的PBS)浸泡兩次,每次5分鐘。用無菌剪刀修剪組織,在100mm細胞培養(yǎng)皿中去除皮下脂肪層,然后稱重皮膚組織。將組織轉移到另一個100mm無菌培養(yǎng)皿中,將真皮一側朝下,然后用手術刀將皮膚組織切成3-4mm寬的條狀。將2.5 mg/ml的解離酶液10 ml加到培養(yǎng)皿中,再置入皮膚組織,4℃孵育過夜。第二天,用鑷子把真皮層上的表皮剝下來,用手術刀片將剝離下來的表皮切碎成勻漿狀態(tài),然后,用10ml 0.25%的胰蛋白酶在50ml的離心管中重懸,在37℃的水浴中震蕩消化20分鐘。通過加入等量的中和溶液來中和胰蛋白酶的活性。分離的表皮細胞懸浮液上下震蕩20次,再用10ml移液管將細胞懸浮液通過100μm細胞過濾器,以去除任何殘留的組織碎片。然后離心,重懸,清洗后再離心。用表皮細胞培養(yǎng)基將離心管底部的細胞團塊重懸,移入培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)。2-3天換液,細胞長滿時傳代。接下來,比較兩種方法的耗時與復雜性,以及對所提細胞數(shù)量與質量的比較。我們將分別用兩種方法培養(yǎng)的原代細胞于第3天、第5天進行觀察,并比較第7天細胞數(shù)目上的不同,再將細胞培養(yǎng)至可傳代的密度,分別記錄所耗時間。另外,為了測定表皮干細胞的干性與純度,我們將改良方法所獲得的原代、第3代表皮干細胞進行細胞爬片,并在其生長至合適密度時對其進行K5、Loricrin、Veminten的免疫熒光染色。結果:(1)傳統(tǒng)方法分離人體表皮干細胞時需經歷一個過夜的酶消化過程,較為耗時,并且會影響細胞生命力。另外,由于需要將表皮從真皮上剝離,增加了方案的復雜性,還會損失部分表皮細胞。對于一些難以將表皮剝離的組織,這種方法的提取效率會大打折扣。而通過新方法的改良則省去了剝離表皮這一步驟,簡化了提取過程,提高了效率�？倳r間約九十多分鐘的酶消化過程也大大縮短了新方法的耗時,同時在一定程度上保證了細胞的生命力。(2)對于傳統(tǒng)方法提取出的原代表皮干細胞,細胞生長速率較慢;而新方法利用了Y-27632增強表皮細胞功能的作用,使提取的角質形成細胞生長速率快且呈菌落式增殖。對新方法提取的原代細胞及傳代后的細胞進行K5、loricrin、Vimentin免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)細胞的分化潛能高,維持了上皮基底細胞的特性。結論:體外培養(yǎng)的人體原代表皮干細胞已經被越來越多的應用于臨床與科研領域。因此對于提取出的原代表皮干細胞的數(shù)量與質量有較高的要求,而傳統(tǒng)提取成人原代細胞的方法不能很好的滿足以上兩個要求。本實驗改進了現(xiàn)有方法的不足之處,縮短了酶消化時間,簡化了細胞提取步驟,并利用Rho蛋白激酶抑制劑Y-27632提高原代角質形成細胞的增殖與貼壁,從而增加了細胞或的數(shù)量與細胞的干性。因此,本實驗研究出的新方法可以獲得高質量、足量的人體表皮干細胞,可以更好地應用于臨床與科研領域。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2
【圖文】：

圖２實驗一改良方法提取原代表皮細胞操作步驟逡逑３０逡逑

圖４：實驗二第３天、第５天細胞生長狀態(tài)及到達傳代密度所需時間逡逑３２逡逑

圖５：實驗二第７天原代細胞數(shù)目逡逑

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