【摘要】：“間接譜系轉(zhuǎn)化”技術(shù)借助基因載體,通過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子,將已分化的體細(xì)胞重編程成為特定譜系的祖細(xì)胞,為再生醫(yī)學(xué)提供了安全、高效的新途徑。神經(jīng)細(xì)胞軸突外的髓鞘對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)傳導(dǎo)和腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要,髓鞘的缺失或功能障礙會(huì)導(dǎo)致眾多疾病,例如多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis,MS)和腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良。少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(Oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的移植是治療髓鞘相關(guān)疾病的一種潛在方法。然而,體內(nèi)OPCs在大腦中僅占約5-8%,且在成人腦中維持緩慢增殖或靜止的狀態(tài)。因此,在腦損傷后,通過OPCs分化成為少突膠質(zhì)細(xì)胞(Oligodendrocytes,OLs)進(jìn)而修復(fù)損傷髓鞘的能力十分有限。鑒于此,本研究通過過表達(dá)三種神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子(Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10),將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryonic fibroblast,MEFs)——NIH/3T3細(xì)胞重編程成為誘導(dǎo)性少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞(Induced oligodendrocyte precursor cells,iOPCs),其形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)與原代OPCs相似,并具有體外分化的能力,為脫髓鞘疾病的細(xì)胞代替治療、疾病模型構(gòu)建和藥物開發(fā)等奠定了基礎(chǔ)。試驗(yàn)一:昆明小鼠原代OPCs的體外分離、培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化小鼠OPCs是一種在體外極易受到損傷、不易存活的細(xì)胞。為了優(yōu)化小鼠OPCs的體外分離培養(yǎng)體系,高效獲得OPCs,并將其作為評(píng)估iOPCs質(zhì)量的對(duì)照組,本研究通過探討不同胎齡和消化方法對(duì)OPCs生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞總數(shù)以及存活率的影響,篩選適宜條件,進(jìn)一步優(yōu)化OPCs的分離、純化方案。結(jié)果表明:(1)采用0.125%胰蛋白酶結(jié)合0.25%雞血清消化胎齡為18.5天小鼠胎兒腦皮質(zhì),所得的OPCs數(shù)量最多,與其余處理組之間均存在顯著性差異(P0.05),且極顯著性高于對(duì)照組(P0.01);(2)與1日齡新生小鼠相比,采用胎齡為18.5天的小鼠胎兒更容易分離得到OPCs,僅培養(yǎng)7-9天,細(xì)胞之間出現(xiàn)明顯分層,且增殖速度較快,極大縮短了細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間;(3)無(wú)論是胎齡為18.5天的胎鼠還是1日齡新生小鼠,采用改良后的間隔震蕩純化方法純化OPCs的存活率極顯著性高于傳統(tǒng)純化方法(P0.01),且其純度較高(97%);(4)分離所得OPCs能夠在含有40 ng/mL三碘甲狀腺氨酸(Triiodothyronine,T3)的無(wú)血清誘導(dǎo)培養(yǎng)液中分化成為OLs,在含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中分化成為Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞,且體外分化所得細(xì)胞的純度可達(dá)95%以上。因此,采用胎齡為18.5天的小鼠胎兒進(jìn)行腦皮質(zhì)的采集,經(jīng)0.125%胰蛋白酶結(jié)合0.25%雞血清消化15 min的方法可以獲得具有典型形態(tài)、生長(zhǎng)良好且具有體外定向誘導(dǎo)分化能力的OPCs。試驗(yàn)二:不同載體介導(dǎo)神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子Olig 2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞的條件優(yōu)化為了提高神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子Olig 2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞的效率,為iOPCs的制備奠定基礎(chǔ),本研究分別采用不同濃度(2.5μg/mL、5μg/mL和7.5μg/mL)的非病毒轉(zhuǎn)染載體(Lipofectamine 2000和Lipofectamine LTX)結(jié)合不同濃度(1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL和5μg/mL)的質(zhì)粒DNA,且采用磁納米顆粒載體與質(zhì)粒DNA 1:1結(jié)合后轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞,以綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)基因作為報(bào)告基因,通過比較不同處理組的轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性,篩選出轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小的轉(zhuǎn)染條件。結(jié)果表明:三種試劑的最高轉(zhuǎn)染效率處理組(7.5μg/mL Lipofectamine 2000結(jié)合3μg/mL質(zhì)粒DNA處理組、7.5μg/mL Lipofectamine LTX結(jié)合2μg/mL質(zhì)粒DNA處理組、2μg/mL Poly-MAG結(jié)合2μg/mL質(zhì)粒DNA處理組)之間無(wú)顯著性差異(P0.05)。但是,當(dāng)三種試劑的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高時(shí),Poly-MAG轉(zhuǎn)染試劑對(duì)NIH/3T3細(xì)胞的毒性極顯著性低于Lipofectamine 2000與Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染試劑的細(xì)胞毒性(P0.01)。此外,由于磁性納米顆粒載體Poly-MAG具有順磁性,在外源性磁場(chǎng)的作用下,它能夠快速地吸引至到細(xì)胞表面,有助于Olig 2質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定表達(dá)。因此,宜采用2μg/mL Poly-MAG介導(dǎo)2μg/mL Olig 2質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞。試驗(yàn)三:應(yīng)用“間接譜系轉(zhuǎn)化”技術(shù)重編程N(yùn)IH/3T3細(xì)胞成為iOPCs的可行性研究為了建立NIH/3T3細(xì)胞向iOPCs的“間接譜系轉(zhuǎn)化”體系,本試驗(yàn)采用磁性納米顆粒載體Poly-MAG介導(dǎo)Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10轉(zhuǎn)錄因子在NIH/3T3細(xì)胞中過表達(dá),并對(duì)重編程所得細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、熒光定量PCR(Real-time PCR,RT-PCR)以及Western Blot檢測(cè),旨在獲得iOPCs,為髓鞘再生機(jī)制研究、藥物篩選和細(xì)胞移植治療等奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明:重編程所得細(xì)胞具有以下特征:(1)具有OPCs的典型形態(tài)學(xué)特征,細(xì)胞呈圓形或橢圓形生長(zhǎng),折光性強(qiáng),多數(shù)有兩個(gè)突起,少數(shù)有三個(gè)突起,與小鼠原代OPCs十分類似;(2)表達(dá)OPCs特異性抗原——A2B5,A2B5~+細(xì)胞的數(shù)量占68.37±2.05%;(3)與對(duì)照組相比,重編程所得細(xì)胞的PDGFRα、S100β、NG2和Olig 2基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出極顯著性的上調(diào)(P0.01);(4)能夠體外誘導(dǎo)分化成為MBP~+的OLs和GFAP~+的Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞,其陽(yáng)性率分別為72.67?2.52%和75.36?1.98%;(5)與小鼠原代OPCs相比,iOPCs的A2B5蛋白水平差異不顯著(P0.05),這說明過表達(dá)三個(gè)神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子所得到的細(xì)胞與小鼠原代OPCs相似,有OPCs特異性蛋白A2B5的表達(dá)。因此,采用Poly-MAG介導(dǎo)Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10的過表達(dá)能夠?qū)⒁逊只腘IH/3T3細(xì)胞重編程成為iOPCs。結(jié)論:宜采用0.125%胰蛋白酶結(jié)合0.25%雞血清消化18.5天胎齡昆明小鼠胚胎的腦皮質(zhì),混合培養(yǎng)7-9天后細(xì)胞出現(xiàn)明顯分層,通過間隔震蕩純化方法,可以高效獲得形態(tài)正常、增殖較快且具有分化能力的OPCs;在外源性磁場(chǎng)的作用下,采用2μg/mL Poly-MAG結(jié)合2μg/mL Olig 2質(zhì)粒DNA能夠更為高效地轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞,且細(xì)胞毒性較低;利用該磁性納米顆粒轉(zhuǎn)染體系介導(dǎo)三個(gè)神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子Olig 2、Nkx 6.2和Sox 10的過表達(dá)能夠?qū)IH/3T3細(xì)胞重編程成為iOPCs,為脫髓鞘機(jī)制的研究和相關(guān)疾病的治療等提供了豐富的細(xì)胞資源。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

直接譜系轉(zhuǎn)化 技術(shù)是將已分化的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為另一種類型的細(xì)功能性細(xì)胞的增殖能力有限，經(jīng)移植到體內(nèi)后，該類細(xì)胞很難進(jìn)一無(wú)法達(dá)到治療的目的，同時(shí)，如果移植大量的細(xì)胞，又將增加免疫而，間接譜系轉(zhuǎn)化 技術(shù)是將已分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為特定譜系的祖細(xì)與功能化細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的增殖能力，且能夠在體內(nèi)分化成為特，既避免了倫理爭(zhēng)議又簡(jiǎn)化了流程，極大地減少了自發(fā)性突變和體確定的發(fā)生概率，降低了出現(xiàn)癌變的風(fēng)險(xiǎn)[4, 20]，為細(xì)胞再生治療提安全、高效的新策略。 iOPCs 生成策略的研究進(jìn)展 ， 多 種 細(xì) 胞 例 如 MEFs[21]、 人 子 宮 內(nèi) 膜 基 質(zhì) 細(xì) 胞 （ Hrial-derived stromal cells，hEnSCs）[22]、人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（Human int stem cells，hiPSCs）[23]、神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells，NSCs）[2成 iOPCs 的細(xì)胞啟動(dòng)源（圖 1）。為提高 iOPCs 的生成效率和安全性子、miRNA、小分子物質(zhì)和載體等被用于優(yōu)化 iOPCs 的生成策略。

且細(xì)胞密度大，生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖 2B、圖 3B）；0.125 %胰蛋白酶結(jié)合 4 %雞血清處理組（圖2D、圖 3D）或 0.25 %胰蛋白酶結(jié)合 4 %雞血清處理組（圖 2H、圖 3H）所得 OPCs的數(shù)量少于單獨(dú)使用 0.125 %胰蛋白酶處理組（圖 2A、圖 3A）或 0.25 %胰蛋白

圖 3 不同濃度的胰蛋白酶和雞血清對(duì) 1 日齡新生小鼠 OPCs 體外分離、培養(yǎng)效果的影響A. 0.125 %胰蛋白酶；B. 0.125 %胰蛋白酶+0.25 %雞血清；C. 0.125 %胰蛋白酶+1%雞血清；D. 0.125 %胰蛋白酶+4 %雞血清；E. 0.25 %胰蛋白酶；F. 0.25 %胰蛋白酶+0.25 %雞血清；G. 0.25 %胰蛋白酶+1%雞血清；H. 0.25 %胰蛋白酶+4 %雞血清；I. 對(duì)照組：機(jī)械吹打。標(biāo)尺=25 m。Fig. 3 Effects of different concentrations of trypsin and chicken serumon isolation and culture of Kunming mouse OPCs in vitroA. 0.125 % trypsin; B. 0.125 % trypsin + 0.25 % chicken serum; C. 0.125 % trypsin + 1 % chicken serum; D. 0.125trypsin + 4 % chicken serum; E. 0.25 % trypsin; F. 0.25 % trypsin + 0.25 % chicken serum; G. 0.25 % trypsin + 1 %chicken serum; H. 0.25 % trypsin +4 % chicken serum; I. Control group: mechanical isolation group. Bar=25 m.3.1.2 細(xì)胞總數(shù)采用表 6 所示不同消化方法分別處理胎齡為 18.5 天的胎鼠和 1 日齡小鼠的腦皮質(zhì)，培養(yǎng) 7-9 天后，對(duì)分層細(xì)胞進(jìn)行純化，統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理組所得 OPCs 的細(xì)胞總數(shù)（圖 4）。結(jié)果表明：0.125 %胰蛋白酶結(jié)合 0.25 %雞血清處理組（第 2 組）所得 OPCs 數(shù)量最多，與對(duì)照組（第 9 組）相比差異極顯著（1.34±0.94×106個(gè)/m

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7 賀海鵬;共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張突變蛋白的抑制促進(jìn)體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

8 丁香香;豬組蛋白及其變體表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)豬體細(xì)胞重編程的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

9 宋明民;利用單細(xì)胞克隆胚胎轉(zhuǎn)錄組挖掘體細(xì)胞重編程新的分子標(biāo)記[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2018年

10 栗楠;磁性納米顆粒介導(dǎo)Oct4重編程HEK-293T細(xì)胞為iPSCs的研究[D];西南大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2785003