【摘要】：半乳糖凝集素(Galectins)是凝集素家族中一類較為經(jīng)典的半乳糖結(jié)合蛋白,結(jié)構(gòu)中包含對(duì)β-半乳糖苷具有特殊親和力的1至2個(gè)糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域約由140個(gè)氨基酸構(gòu)成,識(shí)別程度較高且氨基酸序列高度保守。Galectins在許多方面都發(fā)揮著重要的生理功能,例如生長(zhǎng)調(diào)節(jié),細(xì)胞粘附,細(xì)胞凋亡,免疫反應(yīng)等過(guò)程,并且在治療某些疾病中也起到了關(guān)鍵的作用。其中的Galectin-10(Gal-10)是半乳糖凝集素家族中的一種原型半乳糖凝集素,只含有單個(gè)糖基識(shí)別結(jié)構(gòu)域,主要以同源二聚體形式存在,大多分布于嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞中。在體內(nèi)可以特征性地形成雙錐體六角形晶體,又被稱為Charcot-Leyden晶體蛋白(CLC)。嗜酸性粒細(xì)胞存在于呼吸道,淋巴結(jié),脾臟等多種組織,與各種疾病相關(guān),包括哮喘,過(guò)敏性鼻炎,急性髓性白血病(Acute Myelogenous Leukemia,AML)等。自Galectin-10被發(fā)現(xiàn)以來(lái),已有160多年的歷史,其可在人體內(nèi)自發(fā)形成蛋白質(zhì)晶體。Galectin-10的三維晶體結(jié)構(gòu)雖已被解析出來(lái),但是目前的結(jié)果顯示Galectin-10不能結(jié)合乳糖,原因尚未完全清楚。本文的研究思路通過(guò)突變Galectin-10野生型糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵位點(diǎn),重點(diǎn)分析突變體結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系,從突變體的二聚化水平,晶體的結(jié)構(gòu)解析,蛋白活性以及在細(xì)胞中的分布等方面進(jìn)行研究,可為相關(guān)疾病的治療帶來(lái)新的思路和方向。本文具體的研究?jī)?nèi)容、方法以及研究成果介紹如下:首先通過(guò)閱讀已發(fā)表的文獻(xiàn)并分析結(jié)構(gòu),確定Galectin-10野生型的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),然后分別進(jìn)行點(diǎn)突變,合成獲得5個(gè)重組質(zhì)粒,在大腸桿菌中獨(dú)立表達(dá)。利用Ni-NTA親和層析的方法進(jìn)行提取、純化,得到純度較高的蛋白質(zhì)。將得到的Galectin-10野生型及5個(gè)突變蛋白分別進(jìn)行結(jié)晶,通過(guò)坐滴法篩選適合晶體生長(zhǎng)的條件,然后通過(guò)懸滴法對(duì)溶液濃度、pH等晶體條件進(jìn)行優(yōu)化以得到形態(tài)規(guī)則的晶體。通過(guò)比較Galectin-10突變體的結(jié)構(gòu)與野生型蛋白結(jié)構(gòu)之間的區(qū)別,解析突變體與乳糖共結(jié)晶的結(jié)構(gòu),進(jìn)而分析這些突變體對(duì)乳糖的結(jié)合能力和對(duì)蛋白質(zhì)二聚化的影響。結(jié)果顯示突變體E33A能夠微弱地結(jié)合乳糖,而其他蛋白不能。通過(guò)蛋白質(zhì)分子篩層析實(shí)驗(yàn)研究這些Galectin-10突變體的多聚體形式,結(jié)果顯示突變體W127A為單體結(jié)構(gòu),說(shuō)明了127位色氨酸(Trp127)是Galectin-10形成二聚化的關(guān)鍵氨基酸。此外,紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn),糖阻抑實(shí)驗(yàn)以及乳糖膠親和層析實(shí)驗(yàn)用于補(bǔ)充研究Galectin-10野生型及突變體的相關(guān)活性。在紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)中,突變體W127A表現(xiàn)出比野生型Galectin-10及其他突變體更高的血細(xì)胞凝集活性。在紅細(xì)胞凝集糖阻抑實(shí)驗(yàn)中,突變體E33A對(duì)乳糖敏感,而其他突變體不敏感。另外,突變體W127A可與乳糖膠結(jié)合,這表明W127A單體的開(kāi)放碳水化合物結(jié)合位點(diǎn)可以與乳糖結(jié)合。嗜酸性粒細(xì)胞的免疫熒光顯微鏡檢查顯示,在細(xì)胞核中有相當(dāng)數(shù)量的Galectin-10濃縮顆粒。本論文中選擇帶有綠色熒光標(biāo)簽的pEGFP-N1作為表達(dá)載體,利用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。同時(shí)利用細(xì)胞生物學(xué)的技術(shù)手段,包括細(xì)胞傳代培養(yǎng),細(xì)胞轉(zhuǎn)染,細(xì)胞核熒光染色等操作將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)中,觀察其分布和表達(dá)。結(jié)果顯示,EGFP標(biāo)記的Galectin-10野生型及各突變體均勻地分布在HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi),表明Galectin-10可能在細(xì)胞核中進(jìn)行動(dòng)態(tài)交換,而突變體W72A分布在細(xì)胞質(zhì)中,無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核,猜測(cè)Trp72對(duì)于Galectin-10轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中是至關(guān)重要的。
【學(xué)位授予單位】：東北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R363
【圖文】：

圖 1-1 動(dòng)物凝集素的細(xì)胞分布、活性及免疫組分[9]1.1.3 凝集素的結(jié)構(gòu)和活性凝集素是由兩種類型的亞基組成的寡聚體，每個(gè)都通過(guò)疏水區(qū)插入細(xì)胞膜中，并碳水化合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞外。細(xì)胞可以通過(guò)表面的碳水化合物與凝集素相互用，也可以通過(guò)與細(xì)胞表面凝集素結(jié)合的可溶性糖蛋白形成的橋相互作用，或者可以促進(jìn)細(xì)胞-基質(zhì)粘附的細(xì)胞外基質(zhì)中不溶性組分的碳水化合物結(jié)合（圖 1-2）[12]。

圖 1-1 動(dòng)物凝集素的細(xì)胞分布、活性及免疫組分[9]的結(jié)構(gòu)和活性由兩種類型的亞基組成的寡聚體，每個(gè)都通過(guò)疏水區(qū)插結(jié)合結(jié)構(gòu)域位于細(xì)胞外。細(xì)胞可以通過(guò)表面的碳水化合過(guò)與細(xì)胞表面凝集素結(jié)合的可溶性糖蛋白形成的橋相互質(zhì)粘附的細(xì)胞外基質(zhì)中不溶性組分的碳水化合物結(jié)合（

上可以作為研究細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的探針[16]，尤其是并可以在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖。為免疫防御功能的重要體液因子之一，具有多酶、熒光素、鐵蛋白、生物素等物質(zhì)結(jié)合的同光鏡和電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)研究工作中有化，癌變等生物學(xué)演變過(guò)程以及對(duì)腫瘤的診斷素家族中較為重要的成員，結(jié)構(gòu)上都具有 1至 2苷展現(xiàn)出特殊的親和力[18]。該結(jié)構(gòu)域約由 140個(gè) β折疊和無(wú)規(guī)則卷曲的結(jié)構(gòu)[19]，如 Galectin-1的成夾層結(jié)構(gòu)（圖 1-3）[20]。

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