發(fā)布時間：2020-08-07 20:46

【摘要】：IK通道是由鈣離子和電壓雙向門控的鉀離子通道,廣泛分布在機(jī)體多種類型細(xì)胞中,如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肌細(xì)胞等。同時IK通道與細(xì)胞生理活動的調(diào)控密切相關(guān),如細(xì)胞數(shù)目增殖、細(xì)胞遷徙、細(xì)胞凋亡焦亡以及基因控制的細(xì)胞程序性死亡等。目前研究發(fā)現(xiàn)IK通道與惡性腫瘤、氣道重塑、心肌梗死、動脈粥樣硬化、哮喘、腎纖維化、鐮刀形紅細(xì)胞病等多種疾病密切相關(guān)。海南捕鳥蛛毒素-I(HNTX-I)是從海南捕鳥蛛中分離得到的一種高豐度多肽,相對分子量為3608.1 Da,含有33個氨基酸殘基,其序列為ECKGFGKSCVPGKNECCSGYACNSRDKWCKVLL。雖然HNTX-I是至今為止發(fā)現(xiàn)的第一個IK通道的多肽類激活劑,但其活性并不理想,而且HNTX-I毒素與IK通道的相互作用機(jī)制也并不清楚。為了解決上述問題,深入研究HNTX-I毒素與IK通道作用的分子機(jī)制,本實驗合成HNTX-I及其11條突變體,分別為E1K、E1F、E1F-S18K、K3A、F5I、K7A、E15D、R25A、D26A、K27A、K30A。通過膜片鉗實驗驗證發(fā)現(xiàn),合成的HNTX-I的活性和天然的HNTX-I的活性一致,表明合成后復(fù)性的多肽與天然的HNTX-I的結(jié)構(gòu)相同。在HNTX-I的一系列突變體中,K3A、F5I和K7A在40μM濃度下對IK通道無明顯的激活作用,E1F、E1F-S18K和E1K對IK通道的激活率在40μM濃度下均高于HNTX-I的激活率。E1F對IK通道的活性最高,4μM的E1F激活率為20.1%±0.4%,40μM的E1F激活率為78.5%±0.5%,80μM的E1F激活率為112.5%±0.7%,經(jīng)Boltzmann sigmoidal方程擬合E1F對IK通道激活的EC_(50)為8.01μM。上述結(jié)果表明,HNTX-I上的第1、3、5、7位氨基酸殘基可能是毒素結(jié)合IK通道的關(guān)鍵位點,毒素主要利用N端氨基酸作用于IK通道。選取活性最高的HNTX-I突變體E1F研究HNTX-I與IK通道的結(jié)合機(jī)制。首先加入80μM的E1F后IK電流被顯著激活,再加入100nM NS309繼續(xù)能夠激活I(lǐng)K通道電流大約1.25倍,加入1μM的TRAM-34能顯著抑制IK被激活的電流。為了進(jìn)一步探討毒素與通道之間作用的結(jié)合機(jī)制,利用定點突變的方法對IK通道S1-S2、S3-S4、S5-S6的胞外區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描,構(gòu)建了一系列IK通道突變體。在40μM濃度下,E1F對IK通道突變體W141A和T260A無明顯的激活作用,但是對G259A的激活程度明顯增強,說明這三個位點區(qū)域是毒素與通道作用的關(guān)鍵位置。S5-S6區(qū)域的Q229、V231、N232、T234、S238等突變后也顯著的降低了和HNTX-I的親和力�？拷黃6的G259突變后可能由于疏水性減弱使E1F對IK通道的親和力明顯增強,相反T260突變后可能由于極性增強使相互作用力減弱。以上結(jié)果表明,HNTX-I毒素與IK通道相互作用可能是疏水作用的結(jié)果。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R363
【圖文】：

緊鄰 S6 亞基跨膜螺旋的 C 末端是該通道的關(guān)鍵區(qū)域，其內(nèi)部位點可以與鈣調(diào)蛋白- Ca2+復(fù)合物結(jié)合，從而使通道開放，K+IK 通道主要由 Ca2+調(diào)節(jié)，和電壓無直接關(guān)系[51]。 通道是由 Ca2+濃度和電壓雙向門控的鉀離子通道，廣泛存在人并參與調(diào)控細(xì)胞生理活動，如細(xì)胞數(shù)目變化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞凋控制的細(xì)胞程序性死亡等等[52]。目前研究發(fā)現(xiàn)，它與多種疾病胞瘤細(xì)胞（GBM）的遷移和侵襲。由于它嚴(yán)重依賴于 Ca2+信號中存在多種物質(zhì)，能夠激活三磷酸肌醇信號通路，該通路通過RAC 通道促使 Ca2+從胞外流向胞內(nèi)。同時，胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)也會此時，胞內(nèi)的 Ca2+濃度升高激活 IK 通道，該通道在 GBM 細(xì)胞，由此促使 K+向胞外流動，細(xì)胞膜高度極化促使腫瘤細(xì)胞遷移IK 通道與惡性腫瘤、氣道重塑、心肌梗死、動脈粥樣硬化、哮鐮刀形紅細(xì)胞病等多種疾病密切相關(guān)[54-57]。

圖 1-3 Ca2+誘導(dǎo)的 IK 通道 C 端二聚物開閉的作用機(jī)理[59]圓二色譜（CD 譜）法圓偏振光是在交變電流存在的環(huán)境下，石英晶體產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致在電場兩生的光波。圓二色譜(CD 譜)是平面偏振輻射的左右圓偏振光分量的微分吸。也就是說，左右圓偏振光經(jīng)過固有手性或置于手性環(huán)境中的色團(tuán)時，產(chǎn)生振光的振幅差。根據(jù)不同波長下光譜振幅差所反映的信息，我們可以做大致。當(dāng)左右圓偏振光經(jīng)過樣品時，如果樣品中沒有生色團(tuán)，那么穿過樣品后光偏振幅度不會變化，還在原平面上；反之，光波偏振振幅將會改變。不同的團(tuán)會使光波偏振振幅差差異很大。CD 光譜學(xué)是一種測量物質(zhì)結(jié)構(gòu)的手段，一種很好的研究結(jié)構(gòu)生物學(xué)的工具[61]。除此之外，常用的檢測物質(zhì)結(jié)構(gòu)的方有 X 射線晶體學(xué)、NMR 波譜學(xué)、低溫電子顯微鏡等等。

碩士學(xué)位論文 HNTX-I 活性檢測體積等濃度（100 μL, 2 mg/mL）合成的 HNTX-I 和天例混合，同樣借助于分析型Waters2695高效液相色譜系 HPLC 結(jié)果顯示在乙腈濃度大約為 37%、25 min 左峰時間完全一致，峰形、峰面積完全重合，表明兩者質(zhì)譜驗證分子量也與理論值相符合。根據(jù)色譜質(zhì)譜結(jié)-I 與天然的 HNTX-I 的構(gòu)象可能是一致的。

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本文編號：2784508