發(fā)布時(shí)間：2020-08-07 14:48

【摘要】：人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Olfactory Mucosa Mesenchymal Stem Cells,OM-MSCs)是一種可進(jìn)行臨床治療的理想種子細(xì)胞。OM-MSCs的旁分泌作用被解釋為其發(fā)揮組織及神經(jīng)修復(fù)功能的主要機(jī)制,外泌體做為OM-MSCs旁分泌的一種重要的胞外囊泡,對(duì)其生物特性進(jìn)行研究,有著十分重要的臨床價(jià)值。外泌體是一種納米級(jí)的膜性小泡,其中運(yùn)載著來(lái)源于母細(xì)胞的各種蛋白質(zhì)。盡管外泌體包含的核酸、脂質(zhì)等功能分子研究火熱,但蛋白質(zhì)作為生命功能最直接高效的體現(xiàn),其在由外泌體介導(dǎo)的信息傳遞和信號(hào)調(diào)控中發(fā)揮的作用同樣不容忽視。因此,本研究首先采用組織貼壁法從人嗅黏膜組織中分離培養(yǎng)了OM-MSCs,采用經(jīng)典的超速離心法分離純化了OM-MSCs培養(yǎng)上清中的外泌體,并對(duì)分離得到的外泌體的表面標(biāo)志物、粒子濃度、粒徑分布和形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行了分析表征。結(jié)果表明,分離得到的OM-MSCs外泌體符合一般外泌體的特征,純度較高且適用于進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。為了探究OM-MSCs來(lái)源外泌體的蛋白質(zhì)組成及潛在功能,本研究通過(guò)LC-MS/MS質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并對(duì)關(guān)鍵蛋白進(jìn)行了相關(guān)的功能驗(yàn)證。通過(guò)質(zhì)譜分析,共鑒定到304個(gè)OM-MSCs來(lái)源外泌體的蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位主要為囊泡和外泌體,占總蛋白數(shù)的80.4%,其主要作用于細(xì)胞膜上結(jié)合受體,并能夠參與正調(diào)節(jié)生物進(jìn)程和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)程。在構(gòu)建的候選蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中,篩選到了大量與細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的潛在候選蛋白,通過(guò)比對(duì)OM-MSCs的分泌組數(shù)據(jù),從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度,揭示了OM-MCSs來(lái)源外泌體在基于OM-MSCs旁分泌治療機(jī)制中的核心作用。這些候選蛋白質(zhì)多參與了組織創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的信號(hào)通路,而組織創(chuàng)傷修復(fù)的主要生理現(xiàn)象是伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移導(dǎo)致的血管生成。相關(guān)的功能實(shí)驗(yàn)表明,OM-MSCs來(lái)源外泌體能被人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human Brain Microvascular Endothelial Cells,HBMECs)攝取,并促進(jìn)了HBMECs的增殖遷移和體外的血管形成。結(jié)合蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行機(jī)制分析,其可能主要是通過(guò)OM-MSCs外泌體中的HSP90,EGFR,PDGFRB等分子,磷酸化了關(guān)鍵蛋白激酶AKT,活化PI3K/AKT信號(hào)通路導(dǎo)致的,這暗示了OM-MSCs來(lái)源外泌體有著治療腦卒中導(dǎo)致的缺血性腦損傷的潛力。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),也為基于OM-MSCs移植的臨床治療,提供了重要的參考依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

化成細(xì)胞懸液，每管均分 100μL。實(shí)驗(yàn)管中分別加入鼠抗人抗體 CD34- ECD、CD45- PC7、CD90 - FITC、CD34- ECD、CD73- FITC，陰性對(duì)照管加入抗IgG-FITC、IgG- PE 室溫孵育 30 min 后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。2.3.3 外泌體的分離純化本實(shí)驗(yàn)選擇了經(jīng)典的差速超速離心法提取 OM-MSCs 培養(yǎng)上清中的外泌體，這種方法被廣泛的用于外泌體的分離純化及下游的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，具體流程及步驟如圖所示（圖 2-1）。將含 100% 胎牛血清離心過(guò)夜后，收集上清使用 0.22μm針式濾頭除菌，制備成無(wú)外泌體血清。稀釋成 10% FBS 的 D/F-12 高糖培養(yǎng)基對(duì)分離純化的 OM-MSCs 進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng) 48 小時(shí)后收集上清，按照?qǐng)D中步驟進(jìn)行外泌體離心分離，所有離心溫度均設(shè)置為 4℃。最后收集的沉淀用 1×PBS 重懸，按說(shuō)明書(shū)使用 BCA 試劑盒進(jìn)行定量，分裝后直接進(jìn)行下游分析或-80℃保存?zhèn)溆谩?

做好標(biāo)記。用加樣槍，滴 10 μL 樣本懸液于帶膜銅網(wǎng)上，室溫或37 度烤箱靜置 1-5 分鐘（依據(jù)樣本濃度確定）。然后用剪成尖角的濾紙吸去多余液體，用加樣槍滴 10 μL 磷鎢酸染色液在制好樣品的銅網(wǎng)上，1-2 分鐘后，用剪成尖角的濾紙吸去染色液，再滴一滴純水在銅網(wǎng)上，用濾紙吸去，反復(fù)兩三次，洗去多余的磷鎢酸。然后靜置干燥，使用電鏡透射觀察。2.4 結(jié)果與討論2.4.1 OM-MSCs 的形態(tài)觀察OM-MSCs 按貼壁法純化培養(yǎng)后，8-9 天后有呈梭狀和多角形狀的細(xì)胞從組織塊中延伸而出（圖 2-2A）。培養(yǎng)至 12-14 天，細(xì)胞出現(xiàn) 80%~90%的融合，無(wú)明顯接觸抑制，可繼續(xù)傳代。傳代后，細(xì)胞增殖速度明顯加快，形態(tài)上更為趨同，均為成纖維細(xì)胞樣緊密排列，且生長(zhǎng)旺盛，與一般的 MSCs 形態(tài)一致（圖 2-2B）。

人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體分離鑒定及蛋白質(zhì)組學(xué)研究2.4.2 OM-MSCs 的細(xì)胞表面標(biāo)志物分析本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)分離得到的細(xì)胞是否為符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的間充質(zhì)干細(xì)胞。如圖 2-3 所示，實(shí)驗(yàn)分離的 OM-MSCs 不表達(dá)造血系干細(xì)胞表面蛋白標(biāo)志物 CD34 和 CD45，表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞和黏附相關(guān)蛋白標(biāo)志物 CD73、CD90，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物特性，證明從嗅黏膜中分離的成纖維樣細(xì)胞的為間充質(zhì)干細(xì)胞。

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本文編號(hào)：2784137