【摘要】：[目的]血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的遷移與動脈粥樣硬化導致的動脈狹窄閉塞和血管腔內(nèi)治療術后再狹窄的病理進程息息相關,因此對于VSMC遷移的研究便顯得尤為重要。傳統(tǒng)的細胞學遷移實驗方法通量低,實驗一致性較差,可重復性差,存在較大的局限性,制約了 VSMC的遷移表征,同時也降低了對VSMC遷移研究的可信證據(jù)級別。因此,本實驗基于微流控技術,設計3種高通量細胞劃痕遷移芯片,研究細胞遷移的新方法,提高實驗通量的同時,克服實驗一致性差及實驗可控性差的缺點,同時對細胞芯片進行可行性驗證,力爭為VSMC的遷移尋求準確的實驗方法,后續(xù)為VSMC的遷移提供可靠的實驗數(shù)據(jù),進而為VSMC的遷移相關性疾病的防治開拓新的思路及方案。[方法]1.基于微流控技術設計3種不同的高通量細胞遷移方法,即二維細胞加電去硫醇的遷移方法、三維細胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法和二維細胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法;針對不同的方法,設計相應類型的遷移芯片。2.驗證芯片的可行性,是否可以準確表征細胞的遷移。在芯片中接種腫瘤細胞:人肺癌細胞系(A549、H1299)和人宮頸癌細胞系(HeLa),觀察腫瘤細胞在芯片中的接種、生長及遷移,并施以不同的細胞刺激因子:胎牛血清(fetalcalfserum,FBS)和趨化因子CXCL12。3.利用顯微鏡及正置激光共聚焦顯微鏡對細胞遷移前后的情況進行拍照,在Image Pro Plus 6.0中進行圖像處理,并在Lab View中進行細胞計數(shù),實驗結(jié)果用均值±標準差表示,多組間均數(shù)比較采用ANOVA檢驗,檢驗水準為P0.05(或0.01)代表組間差異有統(tǒng)計學意義(或高度統(tǒng)計學意義)。并利用遷移曲線直觀表征遷移情況。4.通過實驗結(jié)果分析不同芯片的優(yōu)劣,進一步施以改進。5.對VSMC的遷移進行初步研究。[結(jié)果]1.3種遷移芯片制作工藝流程明確、成熟。2.腫瘤細胞及VSMC在高通量遷移芯片中接種后,均能鋪滿遷移芯片,在遷移芯片中生長狀態(tài)良好,并可以在芯片中進行遷移。3.3種不同的遷移方法結(jié)果表明,1)二維細胞加電去硫醇的遷移方法中,腫瘤細胞可以進行遷移。但是,由于此芯片結(jié)構(gòu)較復雜,加電穩(wěn)定性差,在進行細胞培養(yǎng)及去除硫醇時存在一定難度,遷移結(jié)果一致性較差;2)三維細胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法中,細胞培養(yǎng)至三維狀態(tài)需要時間較長,硫醇與金表面的附著能力下降,修飾效果隨之下降,金表面出現(xiàn)細胞殘留,后續(xù)遷移結(jié)果存在一定的誤差;3)二維細胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法中,遷移結(jié)果一致性較好,結(jié)果可信度高,腫瘤細胞及VSMC均可以進行遷移。4.在二維細胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法中,施以不同的細胞刺激物,結(jié)果表明,1)H1299細胞在FBS及CXCL12趨化因子中,表現(xiàn)出不同的遷移狀態(tài);HaLe細胞在FBS中遷移狀態(tài)不同于H1299;2)不同F(xiàn)BS百分比及不同CXCL12濃度對H1299遷移有不同的刺激作用,不同F(xiàn)BS百分比對HaLe細胞有不同的刺激作用;3)VSMC在此芯片中遷移一致性好。[結(jié)論]1.高通量細胞遷移芯片設計合理,工藝流程穩(wěn)定。2.高通量細胞遷移方法實驗一致性好,實驗結(jié)果可信度較高。3.3種芯片均可實現(xiàn)細胞的培養(yǎng)、生長及遷移;經(jīng)驗證,二維細胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法受其他實驗條件變化的影響更小,穩(wěn)定性好,實驗一致性較好。4.二維細胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法更適用于VSMC的遷移研究。
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2
【圖文】：

解放軍醫(yī)學院博士學位論文ＭＳ陽模，抽真空，并烘烤（ｂ）；烘烤后進行ＰＤＭＳ翻模（ｃ）；將Ｐ寸進行切割，并進行打孔，便得到９６個通孔的ＰＤＭＳ遷移小室（ｄ預聚物和固化劑的配比時，一定嚴格按比例進行配比，尤其是固化致ＰＤＭＳ硬度發(fā)生變化，影響后續(xù)的鍵和過程。澆注ＰＤＭＳ陽模抽至完全沒有氣泡，若殘存氣泡無法抽凈，可用吹塵球輕輕吹破氣理時，操作應輕柔，多次反復進行翻模，用力不均或用力太大可能導致相鄰兩個遷移小孔聯(lián)通。另外，ＰＤＭＳ制備后應盡快使用，否使ＰＤＭＳ變形，在與金結(jié)構(gòu)表面進行鍵和時導致位置不準確。逡逑ａｂ

圖１－３金基底的制備逡逑１．４．３芯片組裝逡逑圖１－４展示了芯片的組裝過程。將Ｈ３ＭＳ和金基底同時放入Ｐｌａｓｍａ邋Ｃｌｅａｎｅｒ逡逑中進行處理（ａ）；取出后將ＰＤＭＳ通孔與金基底的金結(jié)構(gòu)邐對準，快速進行鍵和逡逑（ｂ）

４０邋ｍｍ邐＾ＡＯｍｒｎ＾逡逑圖１－３金基底的制備逡逑１．４．３芯片組裝逡逑圖１－４展示了芯片的組裝過程。將Ｈ３ＭＳ和金基底同時放入Ｐｌａｓｍａ邋Ｃｌｅａｎｅｒ逡逑中進行處理（ａ）；取出后將ＰＤＭＳ通孔與金基底的金結(jié)構(gòu)邐對準，快速進行鍵和逡逑（ｂ）

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 賈倩;李彥平;賈進舉;劉宏斌;;雷帕霉素藥物洗脫支架的早中期安全性及有效性評價[J];解放軍醫(yī)學院學報;2014年01期

本文編號：2782518