【摘要】：[目的]血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的遷移與動脈粥樣硬化導(dǎo)致的動脈狹窄閉塞和血管腔內(nèi)治療術(shù)后再狹窄的病理進(jìn)程息息相關(guān),因此對于VSMC遷移的研究便顯得尤為重要。傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)遷移實驗方法通量低,實驗一致性較差,可重復(fù)性差,存在較大的局限性,制約了 VSMC的遷移表征,同時也降低了對VSMC遷移研究的可信證據(jù)級別。因此,本實驗基于微流控技術(shù),設(shè)計3種高通量細(xì)胞劃痕遷移芯片,研究細(xì)胞遷移的新方法,提高實驗通量的同時,克服實驗一致性差及實驗可控性差的缺點,同時對細(xì)胞芯片進(jìn)行可行性驗證,力爭為VSMC的遷移尋求準(zhǔn)確的實驗方法,后續(xù)為VSMC的遷移提供可靠的實驗數(shù)據(jù),進(jìn)而為VSMC的遷移相關(guān)性疾病的防治開拓新的思路及方案。[方法]1.基于微流控技術(shù)設(shè)計3種不同的高通量細(xì)胞遷移方法,即二維細(xì)胞加電去硫醇的遷移方法、三維細(xì)胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法和二維細(xì)胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法;針對不同的方法,設(shè)計相應(yīng)類型的遷移芯片。2.驗證芯片的可行性,是否可以準(zhǔn)確表征細(xì)胞的遷移。在芯片中接種腫瘤細(xì)胞:人肺癌細(xì)胞系(A549、H1299)和人宮頸癌細(xì)胞系(HeLa),觀察腫瘤細(xì)胞在芯片中的接種、生長及遷移,并施以不同的細(xì)胞刺激因子:胎牛血清(fetalcalfserum,FBS)和趨化因子CXCL12。3.利用顯微鏡及正置激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞遷移前后的情況進(jìn)行拍照,在Image Pro Plus 6.0中進(jìn)行圖像處理,并在Lab View中進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),實驗結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間均數(shù)比較采用ANOVA檢驗,檢驗水準(zhǔn)為P0.05(或0.01)代表組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(或高度統(tǒng)計學(xué)意義)。并利用遷移曲線直觀表征遷移情況。4.通過實驗結(jié)果分析不同芯片的優(yōu)劣,進(jìn)一步施以改進(jìn)。5.對VSMC的遷移進(jìn)行初步研究。[結(jié)果]1.3種遷移芯片制作工藝流程明確、成熟。2.腫瘤細(xì)胞及VSMC在高通量遷移芯片中接種后,均能鋪滿遷移芯片,在遷移芯片中生長狀態(tài)良好,并可以在芯片中進(jìn)行遷移。3.3種不同的遷移方法結(jié)果表明,1)二維細(xì)胞加電去硫醇的遷移方法中,腫瘤細(xì)胞可以進(jìn)行遷移。但是,由于此芯片結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,加電穩(wěn)定性差,在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)及去除硫醇時存在一定難度,遷移結(jié)果一致性較差;2)三維細(xì)胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法中,細(xì)胞培養(yǎng)至三維狀態(tài)需要時間較長,硫醇與金表面的附著能力下降,修飾效果隨之下降,金表面出現(xiàn)細(xì)胞殘留,后續(xù)遷移結(jié)果存在一定的誤差;3)二維細(xì)胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法中,遷移結(jié)果一致性較好,結(jié)果可信度高,腫瘤細(xì)胞及VSMC均可以進(jìn)行遷移。4.在二維細(xì)胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法中,施以不同的細(xì)胞刺激物,結(jié)果表明,1)H1299細(xì)胞在FBS及CXCL12趨化因子中,表現(xiàn)出不同的遷移狀態(tài);HaLe細(xì)胞在FBS中遷移狀態(tài)不同于H1299;2)不同F(xiàn)BS百分比及不同CXCL12濃度對H1299遷移有不同的刺激作用,不同F(xiàn)BS百分比對HaLe細(xì)胞有不同的刺激作用;3)VSMC在此芯片中遷移一致性好。[結(jié)論]1.高通量細(xì)胞遷移芯片設(shè)計合理,工藝流程穩(wěn)定。2.高通量細(xì)胞遷移方法實驗一致性好,實驗結(jié)果可信度較高。3.3種芯片均可實現(xiàn)細(xì)胞的培養(yǎng)、生長及遷移;經(jīng)驗證,二維細(xì)胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法受其他實驗條件變化的影響更小,穩(wěn)定性好,實驗一致性較好。4.二維細(xì)胞膠原覆蓋硫醇的遷移方法更適用于VSMC的遷移研究。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2
【圖文】：

解放軍醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文ＭＳ陽模，抽真空，并烘烤（ｂ）；烘烤后進(jìn)行ＰＤＭＳ翻模（ｃ）；將Ｐ寸進(jìn)行切割，并進(jìn)行打孔，便得到９６個通孔的ＰＤＭＳ遷移小室（ｄ預(yù)聚物和固化劑的配比時，一定嚴(yán)格按比例進(jìn)行配比，尤其是固化致ＰＤＭＳ硬度發(fā)生變化，影響后續(xù)的鍵和過程。澆注ＰＤＭＳ陽模抽至完全沒有氣泡，若殘存氣泡無法抽凈，可用吹塵球輕輕吹破氣理時，操作應(yīng)輕柔，多次反復(fù)進(jìn)行翻模，用力不均或用力太大可能導(dǎo)致相鄰兩個遷移小孔聯(lián)通。另外，ＰＤＭＳ制備后應(yīng)盡快使用，否使ＰＤＭＳ變形，在與金結(jié)構(gòu)表面進(jìn)行鍵和時導(dǎo)致位置不準(zhǔn)確。逡逑ａｂ

圖１－３金基底的制備逡逑１．４．３芯片組裝逡逑圖１－４展示了芯片的組裝過程。將Ｈ３ＭＳ和金基底同時放入Ｐｌａｓｍａ邋Ｃｌｅａｎｅｒ逡逑中進(jìn)行處理（ａ）；取出后將ＰＤＭＳ通孔與金基底的金結(jié)構(gòu)邐對準(zhǔn)，快速進(jìn)行鍵和逡逑（ｂ）

４０邋ｍｍ邐＾ＡＯｍｒｎ＾逡逑圖１－３金基底的制備逡逑１．４．３芯片組裝逡逑圖１－４展示了芯片的組裝過程。將Ｈ３ＭＳ和金基底同時放入Ｐｌａｓｍａ邋Ｃｌｅａｎｅｒ逡逑中進(jìn)行處理（ａ）；取出后將ＰＤＭＳ通孔與金基底的金結(jié)構(gòu)邐對準(zhǔn)，快速進(jìn)行鍵和逡逑（ｂ）

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 賈倩;李彥平;賈進(jìn)舉;劉宏斌;;雷帕霉素藥物洗脫支架的早中期安全性及有效性評價[J];解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2014年01期

本文編號：2782518