【摘要】：目的膿毒癥是宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)而出現(xiàn)危及生命的器官功能障礙的臨床綜合征,膿毒癥中重要器官的損傷是其致死的主要原因,尤其是肝臟。然而,膿毒癥性肝損傷的致病機制迄今尚未闡明,臨床療效亦不理想。既往研究表明,生長分化因子-15(GDF-15)作為一種新的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族成員,其功能涉及到免疫抑制、抗凋亡和抗炎等方面。GDF-15在發(fā)生心、肝、腎功能衰竭患者中明顯增高,且GDF-15過表達可保護腎臟和心臟免受LPS誘導(dǎo)的器官損傷。那么GDF-15是否在膿毒癥性肝損傷中發(fā)揮作用,其作用機制究竟如何仍待進一步探討。本研究中,我們擬通過LPS和D-GalN誘導(dǎo)小鼠膿毒癥性肝損傷建立動物模型,從而探討GDF-15是否在內(nèi)毒素性肝損傷中發(fā)揮作用以及其內(nèi)在作用機制。方法通過對小鼠腹腔內(nèi)注LPS和D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷模型。采用全自動生化分析儀檢測肝功能指標(biāo),HE染色觀察小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)改變,ELISA法檢測血清和肝組織中促炎癥因子的水平,硫代巴比妥酸法和四甲基聯(lián)苯胺法檢測肝組織中氧化損傷標(biāo)志物MDA和MPO水平,從而來分析GDF-15在內(nèi)毒素性肝損傷中的作用。進一步對GDF-15作用機制的研究中,我們采用免疫熒光染色法和流式細胞術(shù)檢測小鼠肝組織和枯否細胞中iNOS陽性細胞比率,熒光定量PCR法檢測枯否細胞中iNOS mRNA的表達;ELISA法檢測小鼠肝組織和枯否細胞培養(yǎng)上清中COX-2和MCP-1的表達;免疫蛋白印跡法檢測NF-kB信號通路分子的表達。結(jié)果LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠表現(xiàn)出明顯肝細胞損傷和炎癥細胞在肝組織中的浸潤,肝組織中MDA、MPO和促炎癥因子(IL-6、TNF-α和IL-1β)的水平明顯升高,血清中肝功能指標(biāo)ALT/AST和促炎癥因子水平明顯升高;而GDF-15可以顯著減輕LPS/D-GalN的肝損傷作用和促炎癥因子水平。進一步研究中,GDF-15干預(yù)可明顯降低LPS誘導(dǎo)后小鼠肝組織和枯否細胞中iNOS+巨噬細胞的比率和iNOS mRNA的表達;另外,巨噬細胞相關(guān)的促炎癥因子COX-2和MCP-1的表達亦明顯降低;最后在LPS誘導(dǎo)的枯否細胞中,GDF-15明顯下調(diào)了枯否細胞中NF-kBp65、p-TAK1、p50和p-IκBα的蛋白水平表達。結(jié)論綜上,我們成功地建立了LPS/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠模型,并首次揭示了GDF-15通過下調(diào)促炎癥因子的水平,在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥性肝損傷中起到了良好的保護作用。GDF-15對膿毒癥性肝損傷的保護作用可能是通過減少促炎性肝巨噬細胞的數(shù)量和細胞的活化來介導(dǎo)的;其分子機制可能是GDF-15在肝組織中通過阻斷細胞轉(zhuǎn)化生長因子激酶1(TAK1)的磷酸化,從而抑制了下游IκBα-NF-κB信號通路的活化。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R459.7;R575;R-332
【圖文】：

４４０．７１±６５．３２Ｕ／Ｌ，與正常對照組（４１．５３±２１．４９和８２．１８±３７．４０Ｕ／Ｌ）比較均明站升逡逑高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ＡＬＴ：邋ｔ＝６．７４１，／？＝０？０００；邋ＡＳＴ：邋ｔ＝１１．００９，；；＝０．０００）（表邋１－２，逡逑圖１－２）。逡逑１１逡逑

邐ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ邋＾邋＾逡逑—■ｐｗｉｉ］邋ｎ逡逑圖１－１邋ＨＥ檢測建模后肝組織的形態(tài)逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－１邋Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ邋ａｎｄ邋ｅｏｓｉｎ邋（Ｈ＆Ｅ）邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆｌｉｖｅｒｓ逡逑ｐ＜０．０１，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＰＢＳ邋ｇｒｏｕｐ逡逑１．２．２血清中ＡＬＴ和ＡＳＴ表達情況逡逑血清ＡＬＴ、ＡＳＴ水平是臨床反映肝細胞完整性，以及肝損傷和壞死程度的敏逡逑感指標(biāo)，ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ處理組小鼠血清中ＡＬＴ和ＡＳＴ分別為２０７．４５±５４．２５和逡逑４４０．７１±６５．３２Ｕ／Ｌ，與正常對照組（４１．５３±２１．４９和８２．１８±３７．４０Ｕ／Ｌ）比較均明站升逡逑高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ＡＬＴ：邋ｔ＝６．７４１，／？＝０？０００；邋ＡＳＴ：邋ｔ＝１１．００９，；；＝０．０００）（表邋１－２，逡逑圖１－２）。逡逑１１逡逑

邐＾邋２００－逡逑？邋：邋ｃ／邐�！�，逡逑圖１－２邋ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ誘導(dǎo)對ＡＬＴ／ＡＳＴ活性的影響逡逑Ｆｉｇｕｒｅｌ－２邋Ｔｈｅ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｓｅｒｕｍ邋ＡＳＴ邋ａｎｄ邋ＡＬＴ邋ｉｎ邋ｒｅｓｐｏｎｓｅ邋ｔｏ邋ＬＰＳ／邋Ｄ－ＧａｌＮ邋ｉｎ邋ｍｉｃｅ逡逑＊＊，邋ｐ＜０．０１，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＰＢＳ邋ｇｒｏｕｐ逡逑１．２．３肝組織中ＭＤＡ和ＭＰＯ的水平逡逑ＭＤＡ含量的高低反映了機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映了機體細胞受逡逑自由基攻擊導(dǎo)致細胞損傷的程度。作為中性粒細胞標(biāo)志的ＭＰＯ，其活性的高低逡逑亦反映了脂質(zhì)氧化程度，因此ＭＰＯ水平的高低可作為炎癥反應(yīng)損傷的指標(biāo)。逡逑經(jīng)檢測，結(jié)果顯示僅注射ＰＢＳ的對照組和ＬＰＳ／Ｄ－ＧａｌＮ誘導(dǎo)組小鼠肝臟組織中逡逑ＭＤＡ邋和邋ＭＰＯ邋的水平分別為：０．８４±０．２２邋和邋３．７５±０．４５邋ｎｍｏｌ／ｍｇ、０．０６士０．０２邋和逡逑１２逡逑

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