發(fā)布時間：2020-08-06 13:56

【摘要】：中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能依賴于突觸囊泡進行胞吐釋放神經(jīng)遞質。為了維持突觸傳遞效率,突觸前膜需要經(jīng)過回收,突觸囊泡在突觸末梢再生。關于突觸囊泡膜回收的模式主要有四種:(1)“kiss-and-run”內吞,(2)超快速內吞(ultrafast endocytosis),(3)網(wǎng)格蛋白介導內吞(clathrin-mediated endocytosis,CME)和活性依賴大容量內吞(activity-dependent bulk endocytosis,ADBE)。這些內吞模式啟動的速度、參與的分子組成及對突觸囊泡性質的維持各不相同。谷氨酸能突觸和GABA能突觸作為中樞中最主要的興奮性突觸和抑制性突觸,它們在突觸前囊泡循環(huán)模式及囊泡形態(tài)上有沒有差別?這些差異對其功能又有怎么樣的影響?為了探究兩者在突觸前功能上的差異,本文采用冷凍三維重構和辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)內吞標記物示蹤的方法,發(fā)現(xiàn)興奮性突觸前囊泡形態(tài)學比較均一,囊泡直徑集中在60nm;而抑制性突觸突觸前囊泡形態(tài)差異比較大,含有很多直徑在80nm的內吞體樣囊泡,并且這種囊泡形態(tài)上的差異和它們啟動的不同內吞模式及囊泡循環(huán)方式息息相關,谷氨酸能突觸直接以單個經(jīng)典大小的,均一化囊泡回收方式進行囊泡循環(huán),而GABA能突觸更傾向于采用內吞體作為中轉站重新出芽再生,形成新的突觸囊泡對囊泡池進行補充。為了深入探究GABA能突觸內吞體再生途徑中重要介導分子,本文通過流式分選和蛋白質譜分析相結合,對GAD陽性神經(jīng)元和陰性神經(jīng)元差異性蛋白進行分析,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元特異性銜接蛋白AP3B2在抑制性神經(jīng)元中富集,并以更高比例定位到抑制性突觸末梢,參與調控GABA能突觸中內吞體出芽形成囊泡的過程;AP3B2功能缺陷會導致GABA能突觸末梢堆積大量內吞體樣結構的大囊泡(ELV),而經(jīng)典突觸囊泡(SVS/SVM)數(shù)量顯著減少;AP3B2缺陷導致分選到GABA能突觸部位的標志性蛋白含量顯著下降,但谷氨酸能突觸末梢囊泡形態(tài)和蛋白表達含量均不受影響。同時,AP3B2敲除小鼠表現(xiàn)出過度活躍的特點和癲癇易感性增加等神經(jīng)系統(tǒng)異常的行為學表征。本研究實驗結果說明:1、谷氨酸能突觸和GABA能突觸囊泡形態(tài)的差異和它們囊泡循環(huán)模式息息相關;2、銜接蛋白AP3B2參與調控抑制性GABA能突觸上內吞體出芽再生形成新的突觸囊泡的過程;3、AP3B2可能對抑制性蛋白分揀起關鍵作用;4、GABA能突觸內吞體途徑囊泡再生障礙可能是Ap3b2--小鼠神經(jīng)系統(tǒng)異常的新機制。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R338
【圖文】：

浙江大學博士學位論文邐實驗結果逡逑突觸囊泡偏向更扁平或者不圓（圖ＩＤ，邋１Ｅ）。通過對囊泡直徑和圓度兩個參數(shù)進逡逑行線性關系分析發(fā)現(xiàn)，海馬腦片中ＧＡＢＡ能突觸囊泡直徑越大，囊泡圓度變小，逡逑即囊泡更扁平，囊泡直徑和圓度呈現(xiàn)負相關（圖ＩＦ，邋１Ｇ）。上述結果說明谷氨酸逡逑能突觸和ＧＡＢＡ能突觸突觸前囊泡呈現(xiàn)不同直徑大小和不同形態(tài)分布的特征，逡逑ＧＡＢＡ能突觸前大囊泡比例更高，而且形狀趨向于扁平狀。逡逑Ａ邋｜邐Ｓｌｉｃｃｒ邋（ＸＹ）邋￣［Ｉ邋３Ｄ邋Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋（ＸＹＺ）邋｜邋Ｂ邐ＦＦ－ｃｒｙｏ－ＥＴ邐ＨＰＦ／ＦＳ－ＥＴ逡逑

實驗結果逡逑本研究在對海馬腦片進行掃描透射電子顯微鏡電子斷層掃描重構（ＳＴＥＭ－ＥＴ）逡逑（圖２Ａ）和高壓冷凍及冷凍替代重構（ＨＰＦ／ＦＳ－ＥＴ）（圖２Ｂ）也發(fā)現(xiàn)興奮性突觸逡逑前的囊泡在形態(tài)上都比較均一，同質性很高；而抑制性突觸末梢含有在直徑和大逡逑小形態(tài)上都呈現(xiàn)多樣化的囊泡，異質性更顯著的特點。逡逑Ａ邋｜邋ＳＴＥＭ邋－邋ＸＹ邋Ｓｌｉｃｅｒ邋｜｜邐３Ｄ邋ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ￣｜邋Ｂ邋｜邐ＦＩＢ邋－邋ＸＹ邋Ｓｌｉｃｅｒ邐｜｜邐３Ｄ邋ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ逡逑■杴＿＿逡逑丨：逡逑圖２海馬腦片ＧＡＢＡ能和谷氨酸能突觸超微結構電鏡三維重構（與圖１匹配）逡逑（Ａ）邐ＧＡＢＡ能（上）和谷氨酸能（下）突觸ＳＴＥＭ－ＥＴ電鏡三維重構中ＸＹ平面逡逑截圖（左上圖、左下圖）和三維重構渲染圖（右上圖、右下圖）。三維重構通過逡逑ｉＭＯＤ軟件勾勒突觸具體形態(tài)，綠色代表突觸前膜，藍色代表突觸后膜；粉色代表逡逑直徑小于４０邋ｎｍ小囊泡（ＳＶＳ）和直徑在４０邋ｎｍ－６０邋ｎｍ之間中等大小囊泡（ＳＶＭ）；逡逑深藍色代表直徑在６０ｎｍ－８０ｎｍ之間的大囊泡（ＳＶＬ）；紅色代表直徑在８０ｎｍ－１００逡逑ｎｍ之間的囊泡（ＥＬＶ）；黃色代表直徑大于１００ｎｍ的囊泡（ＥＬＶ）。比例尺２００逡逑ｎｍ0逡逑（Ｂ）

（Ａ）通過電場刺激（ＥＦ－Ｓ）或高鉀（ＫＣＩ－Ｓ）刺激海馬神經(jīng)元內吞辣根過氧化物逡逑酶（ＨＲＰ）示意流程圖。海馬神經(jīng)元用細胞外液（ＥＣＳ）配制的ＨＲＰ邋（丨０ｍｇ／ｍＬ）逡逑進行預孵育，３７°Ｃ邋５分鐘；隨后用４０邋Ｈｚ，邋２００邋ＡＰｓ電場剌激，冰上預冷的細胞外逡逑液迅速涮洗即刻固定（０分鐘），其他時間點的剌激在細胞外液中，３７°Ｃ細胞培養(yǎng)逡逑２９逡逑

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本文編號：2782496