【摘要】：中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能依賴于突觸囊泡進(jìn)行胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)。為了維持突觸傳遞效率,突觸前膜需要經(jīng)過回收,突觸囊泡在突觸末梢再生。關(guān)于突觸囊泡膜回收的模式主要有四種:(1)“kiss-and-run”內(nèi)吞,(2)超快速內(nèi)吞(ultrafast endocytosis),(3)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞(clathrin-mediated endocytosis,CME)和活性依賴大容量內(nèi)吞(activity-dependent bulk endocytosis,ADBE)。這些內(nèi)吞模式啟動的速度、參與的分子組成及對突觸囊泡性質(zhì)的維持各不相同。谷氨酸能突觸和GABA能突觸作為中樞中最主要的興奮性突觸和抑制性突觸,它們在突觸前囊泡循環(huán)模式及囊泡形態(tài)上有沒有差別?這些差異對其功能又有怎么樣的影響?為了探究兩者在突觸前功能上的差異,本文采用冷凍三維重構(gòu)和辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)內(nèi)吞標(biāo)記物示蹤的方法,發(fā)現(xiàn)興奮性突觸前囊泡形態(tài)學(xué)比較均一,囊泡直徑集中在60nm;而抑制性突觸突觸前囊泡形態(tài)差異比較大,含有很多直徑在80nm的內(nèi)吞體樣囊泡,并且這種囊泡形態(tài)上的差異和它們啟動的不同內(nèi)吞模式及囊泡循環(huán)方式息息相關(guān),谷氨酸能突觸直接以單個經(jīng)典大小的,均一化囊泡回收方式進(jìn)行囊泡循環(huán),而GABA能突觸更傾向于采用內(nèi)吞體作為中轉(zhuǎn)站重新出芽再生,形成新的突觸囊泡對囊泡池進(jìn)行補(bǔ)充。為了深入探究GABA能突觸內(nèi)吞體再生途徑中重要介導(dǎo)分子,本文通過流式分選和蛋白質(zhì)譜分析相結(jié)合,對GAD陽性神經(jīng)元和陰性神經(jīng)元差異性蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元特異性銜接蛋白AP3B2在抑制性神經(jīng)元中富集,并以更高比例定位到抑制性突觸末梢,參與調(diào)控GABA能突觸中內(nèi)吞體出芽形成囊泡的過程;AP3B2功能缺陷會導(dǎo)致GABA能突觸末梢堆積大量內(nèi)吞體樣結(jié)構(gòu)的大囊泡(ELV),而經(jīng)典突觸囊泡(SVS/SVM)數(shù)量顯著減少;AP3B2缺陷導(dǎo)致分選到GABA能突觸部位的標(biāo)志性蛋白含量顯著下降,但谷氨酸能突觸末梢囊泡形態(tài)和蛋白表達(dá)含量均不受影響。同時,AP3B2敲除小鼠表現(xiàn)出過度活躍的特點(diǎn)和癲癇易感性增加等神經(jīng)系統(tǒng)異常的行為學(xué)表征。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明:1、谷氨酸能突觸和GABA能突觸囊泡形態(tài)的差異和它們囊泡循環(huán)模式息息相關(guān);2、銜接蛋白AP3B2參與調(diào)控抑制性GABA能突觸上內(nèi)吞體出芽再生形成新的突觸囊泡的過程;3、AP3B2可能對抑制性蛋白分揀起關(guān)鍵作用;4、GABA能突觸內(nèi)吞體途徑囊泡再生障礙可能是Ap3b2--小鼠神經(jīng)系統(tǒng)異常的新機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R338
【圖文】：

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文邐實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑突觸囊泡偏向更扁平或者不圓（圖ＩＤ，邋１Ｅ）。通過對囊泡直徑和圓度兩個參數(shù)進(jìn)逡逑行線性關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，海馬腦片中ＧＡＢＡ能突觸囊泡直徑越大，囊泡圓度變小，逡逑即囊泡更扁平，囊泡直徑和圓度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（圖ＩＦ，邋１Ｇ）。上述結(jié)果說明谷氨酸逡逑能突觸和ＧＡＢＡ能突觸突觸前囊泡呈現(xiàn)不同直徑大小和不同形態(tài)分布的特征，逡逑ＧＡＢＡ能突觸前大囊泡比例更高，而且形狀趨向于扁平狀。逡逑Ａ邋｜邐Ｓｌｉｃｃｒ邋（ＸＹ）邋￣［Ｉ邋３Ｄ邋Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ邋（ＸＹＺ）邋｜邋Ｂ邐ＦＦ－ｃｒｙｏ－ＥＴ邐ＨＰＦ／ＦＳ－ＥＴ逡逑

實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑本研究在對海馬腦片進(jìn)行掃描透射電子顯微鏡電子斷層掃描重構(gòu)（ＳＴＥＭ－ＥＴ）逡逑（圖２Ａ）和高壓冷凍及冷凍替代重構(gòu)（ＨＰＦ／ＦＳ－ＥＴ）（圖２Ｂ）也發(fā)現(xiàn)興奮性突觸逡逑前的囊泡在形態(tài)上都比較均一，同質(zhì)性很高；而抑制性突觸末梢含有在直徑和大逡逑小形態(tài)上都呈現(xiàn)多樣化的囊泡，異質(zhì)性更顯著的特點(diǎn)。逡逑Ａ邋｜邋ＳＴＥＭ邋－邋ＸＹ邋Ｓｌｉｃｅｒ邋｜｜邐３Ｄ邋ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ￣｜邋Ｂ邋｜邐ＦＩＢ邋－邋ＸＹ邋Ｓｌｉｃｅｒ邐｜｜邐３Ｄ邋ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ逡逑■杴＿＿逡逑丨：逡逑圖２海馬腦片ＧＡＢＡ能和谷氨酸能突觸超微結(jié)構(gòu)電鏡三維重構(gòu)（與圖１匹配）逡逑（Ａ）邐ＧＡＢＡ能（上）和谷氨酸能（下）突觸ＳＴＥＭ－ＥＴ電鏡三維重構(gòu)中ＸＹ平面逡逑截圖（左上圖、左下圖）和三維重構(gòu)渲染圖（右上圖、右下圖）。三維重構(gòu)通過逡逑ｉＭＯＤ軟件勾勒突觸具體形態(tài)，綠色代表突觸前膜，藍(lán)色代表突觸后膜；粉色代表逡逑直徑小于４０邋ｎｍ小囊泡（ＳＶＳ）和直徑在４０邋ｎｍ－６０邋ｎｍ之間中等大小囊泡（ＳＶＭ）；逡逑深藍(lán)色代表直徑在６０ｎｍ－８０ｎｍ之間的大囊泡（ＳＶＬ）；紅色代表直徑在８０ｎｍ－１００逡逑ｎｍ之間的囊泡（ＥＬＶ）；黃色代表直徑大于１００ｎｍ的囊泡（ＥＬＶ）。比例尺２００逡逑ｎｍ0逡逑（Ｂ）

（Ａ）通過電場刺激（ＥＦ－Ｓ）或高鉀（ＫＣＩ－Ｓ）刺激海馬神經(jīng)元內(nèi)吞辣根過氧化物逡逑酶（ＨＲＰ）示意流程圖。海馬神經(jīng)元用細(xì)胞外液（ＥＣＳ）配制的ＨＲＰ邋（丨０ｍｇ／ｍＬ）逡逑進(jìn)行預(yù)孵育，３７°Ｃ邋５分鐘；隨后用４０邋Ｈｚ，邋２００邋ＡＰｓ電場剌激，冰上預(yù)冷的細(xì)胞外逡逑液迅速涮洗即刻固定（０分鐘），其他時間點(diǎn)的剌激在細(xì)胞外液中，３７°Ｃ細(xì)胞培養(yǎng)逡逑２９逡逑

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本文編號：2782496