發(fā)布時間：2020-08-06 11:06

【摘要】：研究背景及目的:肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,M.pneumoniae)是學齡期和學齡前期兒童社區(qū)獲得性肺炎中最重要的病原體之一。目前已發(fā)現(xiàn)多種支原體存在與感染密切相關的生物膜結構,而M.pneumoniae在這個方面尚處于基礎理論研究階段。完善M.pneumoniae生物膜形成理論及探索其功能對進一步了解M.pneumoniae感染機制有十分重要的意義。方法:1.通過結晶紫染液微孔法和玻片法驗證M.pneumoniae是否具有在非生命物質(zhì)表面粘附聚集能力;2.通過培養(yǎng)法結合超聲波震蕩技術破壞生物膜結構并檢測其中活菌數(shù)。繪制P1-1型標準株M129,P1-2型標準株FH游離和生物膜中M.pneumoniae生長曲線及同步在掃描電子顯微鏡下觀察M.pneumoniae生物膜形成過程;3.通過臨床采樣分離獲得M.pneumoniae臨床耐藥菌株,同時對其采用雙序列PCR驗證,23SrRNAV區(qū)耐大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變測序,多位點短陣重復序列分型,體外藥敏試驗確定其相關抗生素最小抑菌濃度;4.對P1-1型標準株M129,P1-2型標準株FH及臨床耐藥株Strain 9形成的生物膜,檢測其在不同濃度的阿奇霉素影響下對M.pneumoniae的保護功能,同時對比不同階段的M.pneumoniae生物膜功能強弱;5.通過50℃,不同時長的加熱評估M.pneumoniae生物膜對其抵御高溫的影響。結果:1.通過玻片法和微孔法發(fā)現(xiàn),存在具有活性的M.pneumoniae可使玻片和聚苯乙烯經(jīng)結晶紫染色后吸光度值明顯增高(M129組、FH組vs死菌組、肉湯培養(yǎng)基組:玻片 0.798±0.148、0.807±0.129 vs 0.403±0.058、0.415±0.034;聚苯乙烯 0.284±0.041、0.288±0.025vs0.240±0.033、0.245±0.030;p均0.05),且兩種方法中 M129組和FH組間無顯著差異(t分別為-0.085,0.-226,對應p為0.936,0.825);死菌組和肉湯培養(yǎng)基組間也無顯著性差異(兩組t=-0.293,t=0.-152,p分別為0.784,0.882);2.掃描電子顯微鏡下對比超聲波震蕩處理與否的玻片可見大量M.pneumoniae聚集形成的數(shù)百層“塔”樣結構經(jīng)超聲波震蕩處理后僅余數(shù)層松散結構。M.pneumoniae在37℃,5%CO2環(huán)境中生長繁殖呈“S”型曲線,無論游離狀態(tài)還是在生物膜中,都在96h～120h間達到濃度高峰,隨后迅速下降,游離狀態(tài)在168h,生物膜狀態(tài)在192h時全部死亡。整個過程中生物膜形態(tài)隨時間變化,有粘附,成熟,消散階段,M.pneumoniae單體構成M.pneumoniae生物膜主體,且P1-1型標準株M129和P1-2型標準株FH的形成過程形態(tài)存在差異;3.分離到94株來自門診和13株來自學區(qū)的M.pneumoniae臨床菌株,選取其中的Strain 9作為臨床耐藥株代表,測得菌株為P1分型1型,MLVA分型為U型(5/4/5/7/2),耐藥位點測序顯示為23SrRNAV區(qū)2063A→G突變,體外藥敏實驗顯示其對除麥迪霉素外大環(huán)內(nèi)酯類高度耐藥(紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素MIC均256μg/ml,麥迪霉素 MIC=64μg/ml);4.在早期生物膜72h狀態(tài)組中,游離M.pneumoniae和生物膜中M.pneumoniae均受到1×MIC～4×MIC濃度的阿奇霉素影響而隨時間活菌數(shù)越來越少,其中2×MIC～4×MIC組中在最終96h時均無法檢測到活菌,無論游離狀態(tài)M.pneumoniae還是生物膜中的M.pneumoniae,兩者在各濃度各時段下降速度未有顯著性差異(p均0.05)。在晚期生物膜168h狀態(tài)組中,同樣游離M.pneumoniae和生物膜中M.pneuoniae均受到1×MIC～4×MIC濃度的阿奇霉素影響而隨時間活菌數(shù)越來越少,但在Oh～48h間,游離狀態(tài)活菌下降速度顯著快于生物膜中(0h～24h:-0.52±0.20 vs-0.14±0.09,p=0.040;-1.27±0.19 vs-0.34±0.25,p=0.007;-1.43±0.05 vs-0.98±0.05,p0.001)(24h～48h:-0.53±0.10 vs-0.27±0.08,p=0.021;-1.01±0.18 vs-0.72±0.06,p=0.055;-1.43±0.40vs-0.55±0.10,p=0.021)。生存時間上,在 1×MIC濃度下,游離狀態(tài)M.pneuoniae存活不足96h,而生物膜中M.pneumoniae則存活至96h以后,在2×MIC濃度下,游離狀態(tài)存活不足72h,而生物膜中M.pneumoniae則存活至72h～96h之間,在4×MIC濃度下,兩者均未存活至72h。5.無論是游離狀態(tài),還是生物膜中的M.pneumoniae,在50℃,持續(xù)10min的加熱下,活菌數(shù)沒有明顯變化(p均0.05)。當連續(xù)加熱時間達到20min時,無論是游離還是生物膜中的M.pneumoniae都會明顯失活,存活比例為1/104.01±0.18 vs 1/102.67+0.14,具有顯著性差異(t=10.116,p=0.001)。而降溫后再次進行同樣加熱時,其存活率開始增高1/101.95±0.17 vs 1/101.49±0.14,仍具有顯著性差異(t=3.615,p=0.022)。當連續(xù)加熱時間達到30min時,大部分游離和生物膜中的M。pneumoniae都會死亡,存活比例 1/105.72±0.10 vs 1/105.87±0.31,未及顯著性差異(t=-0.407,p=0.721)。當連續(xù)加熱時間達到40min時,M.pneumoniae無論是游離狀態(tài),還是藏躲于生物膜,都無菌存活。結論:1.在適宜條件下,M.pneumoniae可以在玻片表面形成生物膜,且形態(tài)隨時間和環(huán)境變化,且P1-1型標準株M129和P1-2型標準株FH的形成過程形態(tài)存在差異;2.M.pneumoniae生物膜由M.pneumoniae菌體而非胞外基質(zhì)構成其主體,有別于常見的細菌等微生物;3.M.pneumoniae生物膜對M.pneumoniae保護有限,僅能在抗生素濃度較低、高溫持續(xù)時間較短時延長其中M.pneumoniae生存時間。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R375.2
【圖文】：

表１．４邋ＦＨ菌株游離Ｍ邐及生物膜中Ｍ／ｗｅｗ７ｗｏｍ＿ａｅ數(shù)量逡逑培養(yǎng)時間（ｈ）游離邋Ｍ．邋ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ邋（１０ｘ／ｍｌ）生物膜中邋Ｍ邋／ｗｅｗｗｃｗ／ｆｉｒｅ邋（１０ｘ／ｃｍ２）＊逡逑０邐４．７４±０．０６邐０逡逑２４邐５．３７±０．１２邐４．４７±０．１５逡逑４８邐６．５４±０．２６邐６．４７±０．４８逡逑７２邐７．３４±０．３９邐７．３０士邋０．６８逡逑９６邐８．２１±０．１９邐９．２５±０．０７逡逑１２０邐８．５１±０．４８邐９．３９±０．０５逡逑１４４邐７．８５±１．１３邐８．１１±0．２５逡逑１６８邐３．５９±０．４２邐３．７９±０．６９逡逑

３．３掃描電子顯微鏡下生物膜形成過程逡逑圖１．３至圖Ｕ３展現(xiàn)了生物膜從形成到消亡的全過程。從中可以發(fā)現(xiàn)，Ｍ逡逑／ｗｅｗｍｏｎ／ｗ生物膜的形成的步驟類似于細菌，都起源于粘附，從２４ｈ開始，以單逡逑體的形態(tài)散在粘附于坡片的表面，此時Ｍ１２９和ＦＨ并無明顯差異（圖１．３）。逡逑至４８ｈ時，Ｍ／ｗｅｗｗｏｍ’ｏｅ開始聚集成團，形成數(shù)層形狀不一的空間結構，此逡逑時Ｍ１２９與ＦＨ開始出現(xiàn)差異，前者以球型的單體聚集為主，而后者在形成生物膜逡逑過程中，個體的形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。聚團的單體開始變得細長彎曲，其中一逡逑段膨大，呈“蝌蚪”樣，相互交聯(lián)緊密，形成多層的空間結構，結構外仍緊貼坡逡逑片的單體形態(tài)又有所不同，同樣細長但主體卻更為挺直，彎曲呈折角，類似于“竹逡逑枝”樣，相互之間交聯(lián)成網(wǎng)狀（圖１．４）。逡逑

邐第一部分實驗結果逡逑步增高，出現(xiàn)類似Ｍ１２９中的表面物質(zhì)（圖１．６）。同時從放大１０００倍的圖像中可逡逑以得見由中央向周圍輻散的結構形態(tài)。Ｍ１２９呈中央密集向周圍圓形輻散的特點，逡逑密度隨中央向周圍逐漸減弱至消失，存在邊界。而ＦＨ則除中央結構外，底層向外逡逑輻散成網(wǎng)狀，覆蓋整個底面（圖１．７）。逡逑在１２０ｈ左右，盡管Ｍ／ｗｅｗ／Ｍｏｍ＇ａｅ生物膜中活菌數(shù)檢測達到最高，但部分位逡逑置已經(jīng)開始出現(xiàn)破壞降級現(xiàn)象。Ｍ１２９中聚集形成的結構開始不再保持一致以來圓逡逑柱狀形態(tài)，表現(xiàn)出類似最初的多種形態(tài)，單體也從球型逐漸變?yōu)闄E圓等類球型狀逡逑態(tài)，少數(shù)單體破損嚴重，僅殘留少量膜狀物質(zhì)。ＦＨ較前變化不明顯，周身的表面逡逑覆蓋物質(zhì)也增多，單體形態(tài)較前變化不明顯（圖１．８）。逡逑臨近１４４ｈ時

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