【摘要】：目的:朊病毒疾病是由朊蛋白錯誤折疊引起的一類神經(jīng)退行性疾病,也稱為傳染性海綿狀腦病。錯構(gòu)的朊蛋白結(jié)構(gòu)中α螺旋結(jié)構(gòu)比例下降,β折疊結(jié)構(gòu)比例上升,造成這種錯構(gòu)朊蛋白積聚成纖維狀,引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。這種錯構(gòu)的朊蛋白被稱為朊病毒,可通過食物、血液等在動物中傳播,進(jìn)入宿主內(nèi)的朊病毒可誘導(dǎo)宿主正常朊蛋白錯構(gòu),從而完成疾病的傳染。朊病毒在小鼠和倉鼠之間傳播具有屏障作用,表現(xiàn)為實驗動物的發(fā)病的潛伏期延長,發(fā)病率低下。除了株系的原因之外,朊病毒的傳播屏障主要是由異源朊蛋白的氨基酸位點的差異造成的。小鼠和倉鼠存在11個氨基酸位點的不同,且每個位點對小鼠和倉鼠之間朊病毒傳播的影響程度不同。我們在倉鼠朊蛋白的基礎(chǔ)上構(gòu)建了不同的向小鼠朊蛋白氨基酸突變的多位點突變體朊蛋白,利用PMC A技術(shù)和體外重組朊蛋白技術(shù),探究不同位點組合能否跨越朊病毒在小鼠和倉鼠之間傳播的種屬屏障。方法:在合成的質(zhì)粒模板上,設(shè)計多個位點的突變引物,由倉鼠向小鼠突變。得到的突變載體模板經(jīng)測序正確后,轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21大腸桿菌,挑選單克隆并進(jìn)一步誘導(dǎo)表達(dá)重組朊蛋白。將得到的重組朊蛋白與小鼠朊病毒(PrP~(Sc))一起進(jìn)行PM CA實驗,觀察小鼠朊病毒能否誘導(dǎo)多點位突變倉鼠朊蛋白產(chǎn)生錯構(gòu),通過PK消化處理PMCA產(chǎn)物檢測其PK抗性進(jìn)行驗證。結(jié)果:成功構(gòu)建了7個多點突變的重組朊蛋白基因,其中包括4個3突變位點、2個4突變位點和1個5突變位點。經(jīng)測序正確后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)過Ni-NTA親和層析后得到重組蛋白。在配制底物體系后,與小鼠PrP~(Sc)進(jìn)行P MCA實驗,檢驗轉(zhuǎn)化結(jié)果。結(jié)果顯示HaPrP(M111V-M138I-I204M)轉(zhuǎn)化的構(gòu)象得到了經(jīng)PK消化后具有致病能力的17 kD片段,其他突變體都出現(xiàn)了經(jīng)PK消化后的無致病能力的14 kD片段。結(jié)論:PMCA結(jié)果顯示,經(jīng)過PK消化后,在7種突變體里面只有HaPrP(M111V-M138I-I204M)這個突變體得到了17 kD片段的致病構(gòu)象,沒有出現(xiàn)無致病的14 kD片段無致病構(gòu)象。而其他3突變體及更多位點的4突變體和5突變體既得到經(jīng)PK消化的無致病構(gòu)象14 kD片段也得到了經(jīng)PK消化有致病構(gòu)象的17 kD片段,這2種不同構(gòu)象的同時存在可能不會使接種的動物患病,無法實現(xiàn)跨越種屬屏障。同時M111V、M138I和I204M與先前得到的影響小鼠-倉鼠朊病毒傳播的G54ins、I138M和M204I 3個位點結(jié)果并不完全一致。說明單個氨基酸位點作用并不是簡單的疊加效果,有可能這些位點還存在空間上的相互作用。本文通過重組朊蛋白和PMCA技術(shù),得到了克服小鼠和倉鼠種屬屏障的3突變朊蛋白,闡述了小鼠和倉鼠朊病毒種屬間傳播的關(guān)鍵氨基酸位點,進(jìn)一步驗證了構(gòu)象選擇理論。
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R373
【圖文】：

于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)。除了氨基酸位點的不同之外，越來越多的研究表明朊病毒株系在傳播屏障里起重要作用。典型例子便是變異型克雅氏病 （variant CJD，vCJD）和散發(fā)型克雅氏病（sporadic CJD，sCJD）對小鼠朊蛋白和人朊蛋白的不同傳染特點。兩者的氨基酸序列一致，vCJD 是通過 BSE 傳染得到的，而 sCJD 是自發(fā)形成的，兩者表現(xiàn)出不同的株系特點。其中，sCJD 可以穩(wěn)定傳染給表達(dá)人源朊蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠，但不能傳染給野生型小鼠；而 vCJD 可以高效傳給野生型小鼠朊蛋白[20]。此類發(fā)現(xiàn)引出了構(gòu)象選擇學(xué)說[21-22]。該學(xué)說指出，所有的朊蛋白聚集體，只有一部分與宿主相兼容的才能在宿主體內(nèi)具有致病作用。兩個物種之間兼容構(gòu)象的重疊度解釋了傳播屏障的產(chǎn)生。在這個理論模型下，種屬屏障基本上和株系相關(guān)。傳播屏障也會由于同一物種的朊蛋白的多態(tài)性而發(fā)生，比如人類的 129 位點甲硫氨酸或纈氨酸的不同也會影響朊病毒的傳染和株系選擇[23]。

有 10 個氨基酸位點不同。正是這些氨礙。框架，向倉鼠方向突變，構(gòu)建 11 個小蛋白一起混合，放在 PMCA 條件下孵（圖 1.1）。說明不同氨基酸位點在小揭示了小鼠朊病毒和倉鼠朊病毒傳播204I 和 I138M 突變影響最大。鼠為框架，構(gòu)建向小鼠方向突變的多位 PrPSc作為種子，進(jìn)行孵育得到具有致病毒和倉鼠朊病毒之間的傳播屏障。由鼠朊蛋白片段的質(zhì)粒后，我們設(shè)計了 5

15圖 1.5 點突變 PCR 產(chǎn)物鑒定Figure 1.5 Identification of site mutation PCR production合成的 pET-22b-HaPrP23-231 質(zhì)粒上，為得到多突變體，我們設(shè)在每一輪單點突變后，挑 3 個單克隆菌落送測序，將得到的正確

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本文編號：2779688