【摘要】：研究背景鼠疫是一種自然疫源性疾病,其病原菌是鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)鼠疫菌共含有3個(gè)質(zhì)粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,pCD1質(zhì)粒為鼠疫菌和假結(jié)核耶爾森氏菌所共有,pMT1與pPCP1質(zhì)粒則是鼠疫菌在進(jìn)化過程中外源性獲得的,為鼠疫菌所特有,與鼠疫菌的致病性密切相關(guān)。細(xì)菌中除了蛋白類的調(diào)控因子之外,還存在許多發(fā)揮調(diào)控作用的非編碼RNA(non-coding RNA),在細(xì)菌中也稱作小RNA(small RNA,小 RNA)。小RNA作為調(diào)節(jié)子,可參與細(xì)菌內(nèi)鐵代謝、糖代謝、群體感應(yīng)、外膜蛋白合成、毒力等生理功能的調(diào)控,對(duì)原核生物生理和毒力發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究利用高通量測序技術(shù)對(duì)在不同條件下生長的鼠疫菌提取它的總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,新發(fā)現(xiàn)了104個(gè)小RNA,其中包括pMT1與pPCP1質(zhì)粒上的多個(gè)小RNA,而這兩個(gè)質(zhì)粒又是鼠疫菌在進(jìn)化過程中獲得的,因此驗(yàn)證pMT1與pPCP1質(zhì)粒上小RNA的功能是鼠疫菌致病機(jī)制研究的重要組成部分。本研究旨在利用Northern blot驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的小RNA,并構(gòu)建小RNA的基因缺失株,通過一系列的表型篩選實(shí)驗(yàn),初步探究了小RNA對(duì)鼠疫菌生存能力和致病能力的影響。結(jié)果與討論：(1) 利用Northern blot實(shí)驗(yàn)方法共確定了10個(gè)小RNA的存在,分別為sRl8、sR3425、sR3457、sR3461、sR3446、sR3411、sR4338、sR4340、sR6142和sR6143,又對(duì)本次確定的小RNA和前期驗(yàn)證的部分小RNA做了大小和Hfq依賴性的驗(yàn)證。驗(yàn)證大小的小RNA有sR16、sR271、sR82、sR138、sR524、sR503、sR3446、sR3457、sR3461、sR4338、sR4340、sR6142、sR6143、sR18和sR3411共15個(gè),這些小RNA的大小基本和預(yù)測結(jié)果一致。sR16、sR4338、sR82、sR138和sR510在野生株的表達(dá)量高于Hfq突變株,因此這些小RNA的穩(wěn)定表達(dá)依賴于Hfq蛋白,sR271、sR363、sR524、sR3461、sR18和sR3411在野生株中和Hfq突變株中的表達(dá)量幾乎一樣,且sR503和sR147在野生株中的表達(dá)量低于突變株,這些小RNA的穩(wěn)定表達(dá)不依賴于Hfq蛋白。(2)采用基于λRed重組系統(tǒng)的基因突變技術(shù),共成功構(gòu)建了16株小RNA缺失株分別是ΔsR4338、ΔsR4339、ΔsR4340、ΔsR3457、ΔsR3446、ΔsR6143、ΔsR378、ΔsR3383、ΔsR3440、ΔsR18、ΔsR6094、ΔsR3411、ΔsR6106、ΔsR6097、ΔsR3425和ΔsR3438。同時(shí)在缺失株的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了一株過表達(dá)株,即pBAD-sR3383。(3)利用表型和毒力實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證這些小RNA對(duì)鼠疫菌的生理和毒力的調(diào)控關(guān)系。在生物膜形成方而,sR3446缺失后,鼠疫菌的菌落表而比野生株光滑,因此sR3446可能正調(diào)控鼠疫菌生物膜的形成。當(dāng)sR3425、sR3383、sR3457和sR6143缺失后,鼠疫菌菌落表而變得更加粗糙,因此這幾個(gè)小RNA可能負(fù)調(diào)控鼠疫菌生物膜的形成�；诖宋覀冇诌M(jìn)行了結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn),對(duì)生物膜形成情況做定量分析,結(jié)果顯示sR3446、sR3425、sR3383、sR3457和sR6143對(duì)鼠疫菌生物膜形成的調(diào)控與菌落表面褶皺實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。我們通過在正常條件、高鹽條件和酸性條件下培養(yǎng)鼠疫菌野生株和小RNA突變株分析不同菌株在脅迫條件下生長速率的變化,從而驗(yàn)證小RNA對(duì)鼠疫菌生存能力的影響,結(jié)果顯示只有ΔsR3425缺失株在這三種條件下的生長速率均低于野生株,因此sR3425能夠增強(qiáng)鼠疫菌應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化的能力。我們通過小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了小RNA對(duì)鼠疫菌毒力的影響,利用軟件GraphPad Prism 5對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析并計(jì)算鼠疫菌野生株和小RNA突變株生存曲線差異的P值,當(dāng)P值≤0.05時(shí)認(rèn)為兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果顯示：ΔsR3440、ΔsR3383、ΔsR378、Δ sR6094、4 sR3411、Δ sR4339和ΔsR6097的P值分別為0.0258、0.0075、0.0004、0.0003、0.0267、0.0156和0.0143,因此我們認(rèn)為這些小RNA能夠影響鼠疫菌的毒力。
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378

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本文編號(hào)：2779085