【摘要】：研究背景:骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)由Urist發(fā)現(xiàn)并命名,被認(rèn)為是在肌肉等軟組織中誘導(dǎo)異位骨化的因子,隨后BMPs被證實(shí)也參與機(jī)體的多種器官組織的發(fā)育和形成,在機(jī)體中的多種細(xì)胞中發(fā)揮廣泛的生物作用。BMPs通過激活Smad依賴性通路和非Smad依賴性通路來影響基因表達(dá)。近年來關(guān)于不同物種、不同細(xì)胞、不同時(shí)間干預(yù)BMP信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)均可以導(dǎo)致骨量的不同變化,但具體機(jī)制尚不明了,且存在很大的爭議。目前的研究較多關(guān)注的是骨量的增多與減少,卻很少涉及骨的質(zhì)量問題。骨發(fā)生蛋白1A型受體-BMPR1A(也叫做Alk-3、Brk-1)與BMPs和BMPRII同屬于TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子β)家族,BMPR1A是BMP2,BMP4的強(qiáng)有力的受體,直接影響B(tài)MP2,BMP4在通路中的作用。BMP2是骨誘導(dǎo)因子,可以誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞增生、分化為成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞,在骨的發(fā)生、誘導(dǎo)、修復(fù)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。BMP2可直接或間接參與破骨細(xì)胞的形成、分化、成熟及活性;BMP4是一個(gè)關(guān)鍵的成骨細(xì)胞因子,參與異位骨化的早期病變,對(duì)I型膠原蛋白(COL1)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(Ocn)的表達(dá)有刺激作用;BMP4可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成軟骨細(xì)胞,并促進(jìn)軟骨細(xì)胞的成熟。成骨細(xì)胞由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來,主要參與骨的形成和骨損傷的修復(fù)過程�；钴S的成骨細(xì)胞位于骨形成表面。分化成熟的成骨細(xì)胞合成并分泌胞外基質(zhì)蛋白,包括各種膠原和非膠原蛋白、形成類骨質(zhì)及啟動(dòng)骨的形成。成年機(jī)體的骨形成,受到嚴(yán)格的調(diào)控以維持骨的穩(wěn)態(tài)。成骨細(xì)胞在骨形成過程中要經(jīng)歷成骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)成熟、細(xì)胞外基質(zhì)礦化和成骨細(xì)胞凋亡幾個(gè)階段。很多因素可調(diào)節(jié)這幾個(gè)階段,從而最終調(diào)控骨形成。鑒于成骨細(xì)胞數(shù)量及功能在骨穩(wěn)態(tài)維持中的重要作用,以及BMPR1A介導(dǎo)的BMP信號(hào)通路在骨發(fā)育和骨形成中的重要影響,在本實(shí)驗(yàn)中,我們擬觀察:1.觀察成骨細(xì)胞其可能的機(jī)制;2.觀測(cè)BMPR1A介導(dǎo)的BMP通路對(duì)成骨細(xì)胞終末分化的影響,小鼠骨礦化、膠原合成等能力的影響,是否導(dǎo)致小鼠骨質(zhì)量的變化,并探討其中可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法第一部分:成骨細(xì)胞中敲除bmpr1a在調(diào)控成骨細(xì)胞數(shù)量中的作用1.建立成骨細(xì)胞特異性敲除bmpr1a小鼠模型,并觀察小鼠大體形態(tài),測(cè)量體重和下肢骨長度;2.利用x線攝片、microct掃描、he染色等觀察小鼠骨量變化及骨組織結(jié)構(gòu)變化;3.trap染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)量及功能,brdu免疫組織化學(xué)檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖情況,tunel法觀察成骨細(xì)胞和生長板肥大層細(xì)胞凋亡情況,第二部分:成骨細(xì)胞中敲除bmpr1a對(duì)成骨細(xì)胞終末分化的調(diào)節(jié)作用1.對(duì)小鼠下肢骨標(biāo)本進(jìn)行半脫鈣處理,進(jìn)行vonkossa礦化結(jié)節(jié)染色、masson染色、天狼星紅染色-偏振光顯微鏡等觀察礦化情況及膠原含量的變化,2.利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)成骨細(xì)胞標(biāo)志物osx、runx2、成骨礦化抑制因子opn、fgf23的表達(dá);3.測(cè)定血清中堿性磷酸酶及鈣、磷含量,觀察小鼠鈣磷代謝是否正常;4.小鼠長骨原代成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng),并進(jìn)行成骨誘導(dǎo),茜素紅染色觀察礦化水平,流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。提取細(xì)胞總rna,實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)骨形成與骨吸收相關(guān)基因bmpr1a、β-catenin、rankl、opg的表達(dá)。5.對(duì)小鼠下肢骨標(biāo)本,及牙齒組織標(biāo)本進(jìn)行處理后,掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及骨量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、成骨細(xì)胞中敲除bmpr1a小鼠的松質(zhì)骨骨量增加明顯,主要由于成骨功能增強(qiáng),破骨功能減弱導(dǎo)致。1.通過對(duì)比3.2cre與dmp1cre的表達(dá)位置我們可以明確3.2cre在成骨細(xì)胞中特異性表達(dá),成骨細(xì)胞中敲除bmpr1a動(dòng)物模型成立。2.成骨細(xì)胞中敲除bmpr1a(cko)小鼠與對(duì)照組相比外觀形態(tài)上無明顯差異,但其體型稍小,未見明顯的發(fā)育遲緩征象,但cko小鼠體重減輕,且下肢骨長度與對(duì)照小鼠對(duì)比有所縮短。3.bmpr1a敲除小鼠松質(zhì)骨骨量增加明顯。小鼠下肢骨的x線檢測(cè)發(fā)現(xiàn),cko小鼠長骨干骺端的放射密度較對(duì)照小鼠明顯增高。microct結(jié)果提示在橫截面上,小鼠脛骨從松質(zhì)骨至皮質(zhì)骨cko小鼠骨量均明顯增加,而脛骨組織切片的he染色可見,c KO小鼠的松質(zhì)骨骨量明顯增多,這與正常的長骨結(jié)構(gòu)差異顯著。4.cKO小鼠成骨細(xì)胞增殖及活性顯著增加。其成骨細(xì)胞標(biāo)志RunX2、Osterix表達(dá)升高,BrdU檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖活動(dòng)加強(qiáng),TUNEL凋亡檢測(cè)成骨細(xì)胞凋亡減弱,5.cKO小鼠破骨細(xì)胞活動(dòng)減弱。cKO小鼠的骨組織中破骨細(xì)胞的數(shù)量減少,破骨細(xì)胞標(biāo)志RANKL表達(dá)水平減弱,體外分離培養(yǎng)骨細(xì)胞中RANKL/OPG基因表達(dá)比值有所降低。二、成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A小鼠成骨細(xì)胞終末分化受阻。1.在體與離體礦化染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示cKO小鼠骨組織礦化能力減弱,掃描電鏡結(jié)果提示c KO小鼠的骨細(xì)胞之間失去了正常細(xì)胞間的連接突觸,無細(xì)胞與細(xì)胞間的緊密聯(lián)系,骨皮質(zhì)變薄,且孔隙增多,失去了相互之間致密的連接。2.BMPR1A敲除小鼠骨膠原合成能力減弱,Masson染色發(fā)現(xiàn)cKO小鼠長骨的膠原成分含量與對(duì)照小鼠相比減弱明顯,從膠原成分分析,cKO小鼠長骨中所含膠原大多為III型膠原,I型膠原含量很少,而對(duì)照組小鼠則是Ⅰ型膠原為主,Ⅲ型膠原較少;從膠原的排列上來看,c KO小鼠的膠原排列與對(duì)照組相比顯得雜亂無章,失去了正常的縱向規(guī)律的排列。3.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示c KO小鼠骨組織中骨礦化抑制因子OPN和FGF23的表達(dá)增強(qiáng),血清中鈣水平與對(duì)照小鼠相比升高,而磷水平相對(duì)下降,c KO小鼠成骨細(xì)胞在細(xì)胞周期檢測(cè)中,有更多的細(xì)胞停留在了G期。結(jié)論一、成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A后,小鼠的成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加,破骨細(xì)胞數(shù)量微量減少,小鼠骨量增加明顯。成骨細(xì)胞中BMPR1A信號(hào)通路對(duì)維持正常骨量有重要調(diào)控作用,可以通過調(diào)控成骨細(xì)胞數(shù)量以實(shí)現(xiàn)。二、成骨細(xì)胞中敲除BMPR1A后,小鼠的成骨細(xì)胞終末分化受阻,會(huì)導(dǎo)致成骨細(xì)胞礦化減少、膠原合成能力減弱、骨質(zhì)量下降,成骨細(xì)胞礦化能力的缺陷及骨基質(zhì)成分的表達(dá)減少可能造成了小鼠骨質(zhì)量下降和骨機(jī)械性能的破壞。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

圖 1 成骨細(xì)胞中條件性敲除 BMPR1A 小鼠的建立2.1.2.2 基因型小鼠的鑒定(1)小鼠組織 DNA 基因提取與鑒定：1) 隨機(jī)編號(hào)小鼠（按每籠總只數(shù)），依據(jù)編號(hào)順序剪取小鼠足趾，放置于 1.5m中，EP 管同樣編號(hào)；2) 于裝有小鼠腳趾的 EP 管中加入 180μl 組織裂解液 A(0.025N NaOH, 2TA)，EP 管置于水浴鍋中，100℃水浴 1 小時(shí)，結(jié)束后將裝有腳趾的 EP 管迅速放箱-20°C 冷凍層冷卻 3-5 分鐘。3) 取出 EP 管，加入 180μl 中性緩沖液 B(40mM Tris 溶液)，使用移液槍進(jìn)行反打，盡量使小鼠足趾組織溶解于裂解液中，震蕩混勻，所得溶液即含小鼠 DNA4) 4℃保存含有小鼠 DNA 的 EP 管。(2) PCR 鑒定基因型：引物序列如下所示：

果（A 圖 1、2 泳道為 ROSA26 基因條帶，3 泳道為 marker 基 1 泳道為 marker 基因條帶，2、3 泳道為 BMRP1A 基因雜合子條帶）

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 圖 1 電泳結(jié)果（A 圖 1、2 泳道為 ROSA26 基因條帶，3 泳道為 marker 基因條帶，4 泳道為Cre 基因條帶；B 圖 1 泳道為 marker 基因條帶，2、3 泳道為 BMRP1A 基因雜合子條帶，4 泳道為BMPR1A 基因純合子條帶）

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本文編號(hào)：2778811