【摘要】：成骨細胞是骨組織中重要組分,在骨骼發(fā)育過程中分化產(chǎn)生骨基質(zhì),負責(zé)骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化。它將特定的骨鈣蛋白,堿性磷酸酶和I型膠原分泌到細胞外基質(zhì)中,形成具有支撐功能的骨的最重要部分。成骨細胞上的缺陷會導(dǎo)致骨疾病的發(fā)生,通過靶向成骨細胞會促進骨形成,能加速骨結(jié)構(gòu)與功能性疾病的修復(fù),所以成骨細胞在骨組織中發(fā)揮著重要的作用。Fbxw7是SCF(Skp-Cullin-F-box)泛素連接酶E3復(fù)合物中底物特異性識別的關(guān)鍵因子,控制細胞中大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解。研究表明:Fbxw7可通過骨中的內(nèi)皮細胞Notch MiR-497-195簇靶向Fbxw7和P4HTM,進而影響CD31hi Emcnhi骨內(nèi)皮細胞中的Notch,從而調(diào)節(jié)血管跟骨組織,這提示我們Fbxw7與骨組織之間有重要聯(lián)系。泛素化因子通常被廣泛報道用于腫瘤研究中,可泛素化在骨骼發(fā)育和骨代謝平衡也發(fā)揮著重要的作用,泛素連接酶的功能障礙與骨疾病的發(fā)展密切相關(guān)。有實驗證明:Smurfl,一種HECT類型的泛素連接酶,是重要的骨形成負調(diào)控因子,它的高表達會引起骨量下降。這提示泛素化因子與骨代謝有關(guān)聯(lián)。骨代謝過程包括骨吸收與骨形成,合成骨基質(zhì)的成骨細胞是骨組織不可或缺的組分,在骨代謝中起著重要的作用。Fbxw7是泛素化的重要因子,部分泛素化因子會影響骨代謝。但是,目前尚無確切研究證明Fbxw7基因是否會參與骨代謝,也無研究報道成骨細胞中Fbxw7基因?qū)谴x的的作用。因此本研究旨在通過Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建成骨細胞(Bglap)敲除Fbxw7基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型驗證:Fbxw7基因是否參與了骨代謝,如果參與了骨代謝,Fbxw7基因在成骨細胞中發(fā)揮著怎樣的作用。探究Fbxw究對細胞和動物體內(nèi)的成骨細胞、破骨細胞、相關(guān)物質(zhì)的影響,為骨疾病的防治提供新的依據(jù)。本實驗應(yīng)用Cre-Loxp系統(tǒng)構(gòu)建成骨細胞(bglap)中敲除Fbxw7基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,通過PCR、western blot、免疫組織化學(xué)驗證轉(zhuǎn)基因小鼠的敲除效果。然后通過HE染色、Mirco-CT分析Fbxw7基因?qū)π∈蠊墙M織形態(tài)、結(jié)構(gòu)的影響。通過Trap染色、Ocn染色、ALP染色分析成骨細胞中Fbxw7基因?qū)π∈蠊墙M織成分的影響。另外通過QPCR、western blot、免疫組織化學(xué),探究成骨細胞中Fbxw7基因?qū)π∈蠊墙M織中的蛋白通路的影響。通過以上實驗方法論證:Fbxw7基因是否參與了骨代謝過程。由于成骨細胞是成熟個體中骨髓造血微環(huán)境的關(guān)鍵構(gòu)成成分,成骨細胞功能的變化與多種血液相關(guān)疾病有關(guān)聯(lián),因此本課題還通過流式細胞儀、血常規(guī)儀觀察Bglap-Fbxw7小鼠的造血功能。主要實驗結(jié)果如下:1、Fbxw7基因參與了骨代謝過程。2、成骨細胞敲除Fbxw7基因后,小鼠體重、體長無變化,但敲除組小鼠骨小梁數(shù)量,骨小梁厚度數(shù)值顯著上升。3、成骨細胞敲除Fbxw7基因后,成骨細胞數(shù)量增多。4、成骨細胞敲除Fbxw7基因后,使PCNA蛋白上升、Runx2蛋白下降,成骨細胞增殖增多,成骨細胞分化減少。綜上所述,我們研究表明:Fbxw7基因參與了骨代謝,成骨細胞中敲除Fbxw7基因,會使小鼠骨小梁數(shù)量,骨小梁厚度數(shù)值升高,成骨細胞增殖增加,成骨細胞分化減少,成骨細胞數(shù)目增加。提示在今后骨疾病防治中,Fbxw7基因可能是一個潛在靶點。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2
【圖文】：

我們通過ＰＣＲ、ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ、免疫組化三方面來驗證。逡逑我們剪�。保堤忑g的小鼠鼠尾，鼠尾裂解液裂解，通過ＰＣＲ檢測顯示條帶逡逑ｂｐ大小符合Ｊａｃｋｓｏｎ實驗室的ｐｒｏｔｏｃｏｌ邋（如圖２Ａ所示）。逡逑在超凈臺工作臺中提取３天齡你小鼠的頭蓋骨成骨細胞，做原逡逑代培養(yǎng)七天后，用ＳＤＳ裂解液提取蛋白，ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ檢測Ｋ０組小鼠與Ｃｏｎ逡逑組小鼠Ｆｂｘｗ７蛋白含量。發(fā)現(xiàn)你轉(zhuǎn)基因小鼠里，成骨細胞中Ｆｂｘｗ７逡逑蛋白表達量降低，驗證了敲除效果（如圖２Ｂ所示）。逡逑獲取四月齡的小鼠的股骨，４％多聚甲醛固定，１４％乙二胺四乙酸脫鈣液脫鈣，逡逑５邋ｕ邋ｍ切片，通過免疫組化檢測驗證他＾７轉(zhuǎn)基因小鼠敲除效果，發(fā)現(xiàn)Ｃｏｎ逡逑組成骨細胞中Ｆｂｘｗ７蛋白表達量比Ｋ０組增高，驗證了敲除效果（緊貼骨小梁扁逡逑平細長、梭型細胞為成骨細胞

否發(fā)生變化。我們將一對實驗小鼠（Ｋ０小鼠與Ｃｏｎ小鼠）同一籠飼養(yǎng)，待小鼠逡逑為四Ｗ齡大時，州３０厘米標尺，千分位天平，測量、稱量小鼠體重體長。經(jīng)測逡逑量、稱量、ＳＰＳＳ２０．邋０獨立Ｔ檢驗發(fā)現(xiàn)Ｋ０組、Ｃｏｎ組體重體長無差異（如圖３Ｂ逡逑所示）。逡逑２３逡逑

Ｃｏｎ邐Ｋ0逡逑圖４．取ｉａｐＴ＾ｘＷ小鼠股骨及脛骨ＨＥ染色圖逡逑圖Ａ．邋ＨＥ染色股骨端切片圖（５Ｘ）。圖Ｂ．邋ＨＥ染色脛骨端的切片圖（５Ｘ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４．邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ｂｏｎｅ邋ｉｎ邋Ｂ｝＊ｌａｐ－Ｆｂｘｗ７邋ｍｉｃｅ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ａ．邋ＨＥ邋ｓｔａｉｎｅｄ邋ｆｅｍｏｒａｌ邋ｅｎｄ邋ｓｅｃｔｉｏｎ邋（５ｘ）．邋Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｂ．邋ＨＥ－ｓｔａｉｎｅｄ邋ｓｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｈｕｍｅｒｕｓ邋（５ｘ）．逡逑４．邋２邋Ｍｉｃｒｏ—ＣＴ發(fā)現(xiàn)敲除組小鼠骨量增加逡逑為了進一步探[偝曬竅赴貿(mào)紓蓿范孕∈蠊親櫓撓跋歟婧笪頤腔袼腦鋁洌耍靶∈笥耄茫錚钚∈蟮墓曬牽矗ザ嗑奐茲┕潭āⅲ罰擔(dān)ゾ憑４媯蠼停椋悖潁錚茫隕韞鄄煨∈蠊峭返謀浠ㄍ跡擔(dān)了荊�。通过Ｍｉ}悖錚茫隕杓觳�，辶x希櫻校櫻渝澹玻埃巴臣品治觶っ髁順曬竅赴貿(mào)伲唬蓿坊潁岬賈灤∈蠓⑸橇垮義顯黽擁謀硇停汗切×菏浚ǎ裕潁幔猓澹悖酰歟幔蟈澹危酰恚猓澹潁裕猓澹危�、骨小翝h穸齲ǎ裕潁幔猓澹悖酰歟幔蟈義希裕瑁椋悖耄睿澹螅�，邋Ｔｂ．Ｔｈ）蠟�(zāi)擼兄擔(dān)跡埃埃擔(dān)哂型臣蒲б庖澹ㄈ繽跡擔(dān)濾荊�。辶x

本文編號：2772601