【摘要】：第一部分細(xì)菌鞭毛鉤蛋白FlgE誘導(dǎo)急性肺損傷的免疫機(jī)制目的:微生物成分與免疫系統(tǒng)的相互作用是病-宿互作的重要內(nèi)容。但迄今為止,國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)菌鞭毛鉤蛋白FlgE的免疫相關(guān)特性鮮有報(bào)道。課題組在之前研究中首次發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌鞭毛鉤蛋白FlgE具有顯著的免疫調(diào)控功能,FlgE刺激HCEC和肺組織切片可活化多條與炎癥、免疫反應(yīng)相關(guān)的通路[1]。然而,FlgE作用機(jī)體后引起怎樣的免疫效應(yīng)仍不清楚。本部分以小鼠急性肺損傷模型為研究對(duì)象,闡述由FlgE刺激所引起的急性炎癥的一般特點(diǎn)。方法:原核表達(dá)及純化FlgE蛋白并去內(nèi)毒素。FlgE(250mg/100mL)滴鼻建立小鼠急性肺損傷模型。觀察滴鼻后24 h小鼠肺部病變情況。流式分析肺組織中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的亞群及比例,同時(shí)檢測(cè)脾臟中免疫細(xì)胞的變化。q-PCR檢測(cè)肺組織中炎癥因子的基因表達(dá)水平。ELISA檢測(cè)小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF,Bronchoalveolar lavage fluid)中細(xì)胞因子的表達(dá)水平。熒光顯微鏡觀察肺組織NETs產(chǎn)生情況,并用DNA定量試劑盒檢測(cè)BALF中游離DNA的含量。另外,前期實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)肺上皮細(xì)胞膜表面表達(dá)的CAV1(Caveolin-1)蛋白為FlgE的可能配體之一[1],本實(shí)驗(yàn)中分離CAV1基因敲除(Caveolin-1-/-)小鼠骨髓來(lái)源的中性粒細(xì)胞并給予FlgE刺激,q PCR檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果:成功制備去內(nèi)毒素的FlgE蛋白。FlgE滴鼻24 h后成功建立小鼠急性肺損傷模型。在FlgE誘導(dǎo)的急性肺損傷中,浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞主要是中性粒細(xì)胞,免疫消除中性粒細(xì)胞后炎癥減輕。FlgE刺激后小鼠肺組織和BALF中細(xì)胞因子(如IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-23、G-CSF)和中性粒細(xì)胞趨化因子(如CXCL1、CXCL2和CXCL5)的表達(dá)顯著升高。FlgE刺激后ROS+中性粒細(xì)胞比例升高,而中性粒細(xì)胞凋亡不明顯。此外,熒光顯微鏡下可見(jiàn)FlgE滴鼻后小鼠肺組織中有NETs樣結(jié)構(gòu)存在,同時(shí)BALF中DNA含量顯著升高。然而,體外抑制中性粒細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生并不能阻斷其N(xiāo)ETs的釋放。此外,q PCR結(jié)果顯示,CAV1基因缺失可顯著降低FlgE刺激引起的中性粒細(xì)胞內(nèi)炎癥因子(如IL-1b、IL-6、IL-17A、CXCL1、CXCL2)的表達(dá)。結(jié)論:FlgE刺激小鼠引起炎癥反應(yīng),其主要效應(yīng)細(xì)胞是中性粒細(xì)胞。遷移到炎癥部位的中性粒細(xì)胞以NETs形式發(fā)揮作用。此外,中性粒細(xì)胞膜表面CAV1蛋白可能為FlgE的結(jié)合分子之一。第二部分IL-17A在細(xì)菌鞭毛鉤蛋白FlgE致炎活性中的作用目的:IL-17A是調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞因子,由多種細(xì)胞分泌。初步研究發(fā)現(xiàn)在FlgE滴鼻建立的小鼠急性肺炎模型中IL-17A的基因和蛋白表達(dá)水平均升高。因此本部著重探討IL-17A的缺失對(duì)FlgE引起的急性炎癥的影響。方法:應(yīng)用野生型(WT,wild-type)小鼠和IL-17A基因敲除(Il17a-/-)小鼠,FlgE(250mg/100mL)滴鼻建立小鼠急性肺損傷模型,滴鼻24 h后處死小鼠收樣檢測(cè)。從組織癥病變程度、免疫細(xì)胞細(xì)胞浸潤(rùn)水平以及細(xì)胞因子表達(dá)及分泌三個(gè)方面比較IL-17A缺失對(duì)的FlgE引起的急性肺炎的影響。分離WT小鼠和Il17a-/-小鼠的肺組織,給予FlgE刺激,建立體外培養(yǎng)模型[1],western blot檢測(cè)FlgE刺激不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中STAT3的磷酸化水平,transwell遷移實(shí)驗(yàn)比較FlgE刺激后兩種小鼠肺-組織培養(yǎng)上清對(duì)中性粒細(xì)胞遷移和NETs形成的影響。Percoll密度梯度離心法分離野生型小鼠骨髓來(lái)源中性粒細(xì)胞,采用flow cyto、q PCR、western blot等方法檢測(cè)中性粒細(xì)胞在FlgE刺激下后其自身IL-17A的表達(dá)和STAT3的磷酸化水平。結(jié)果:與WT小鼠相比,FlgE滴鼻后Il17a-/-小鼠肺組織炎性病變及免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度均明顯減低,而預(yù)先免疫消除中性粒細(xì)胞后,FlgE引起的炎癥反應(yīng)程度在兩種小鼠中均減弱。當(dāng)IL-17A缺失后,除IL-23無(wú)明顯差異外,來(lái)源于肺組織和BALF的細(xì)胞因子(如IL-1b、IL-6、G-CSF)和趨化因子(如CXCL1、CXCL2)的基因表達(dá)和蛋白分泌水平均顯著降低。western blot檢測(cè)FlgE刺激相同時(shí)間時(shí)肺組織切片中STAT3的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn),Il17a-/-小鼠肺組織切片中STAT3的活化水平低于WT小鼠肺片的活化水平。盡管用FlgE與野生型小鼠或Il17a-/-小鼠的肺片共培養(yǎng)上清(刺激時(shí)間24 h)做趨化劑都可以顯著增加中性粒細(xì)胞遷移的數(shù)目,然而,當(dāng)IL-17A缺失后此種趨化效應(yīng)明顯低于正常小鼠的趨化效應(yīng)。另外,肺片經(jīng)STAT3抑制劑預(yù)處理后其共培養(yǎng)上清趨化引起的中性粒細(xì)胞遷移數(shù)量減少。骨髓來(lái)源中性粒細(xì)胞在FlgE(5mg/m L、10mg/m L)刺激作用下IL-17A-IL-17RC的基因表達(dá)水平升高、STAT3的磷酸化程度增加。激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞核呈彌散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(NETs,neutrophil extracellular trap)附著于WT小鼠的肺組織,同時(shí)BALF中游離DNA含量以及血清中MPO含量均明顯升高,而IL-17A缺失后中性粒細(xì)胞核多呈典型分葉結(jié)構(gòu)且DNA和MPO檢出量亦遠(yuǎn)低于WT小鼠的含量。FlgE與WT小鼠肺組織共培養(yǎng)上清亦可引起明顯的NETs釋放現(xiàn)象,而IL-17A缺失后此種效應(yīng)減弱。另外,FlgE單獨(dú)刺激中性粒細(xì)胞可引起NETs釋放,而IL-17A單獨(dú)作用并不能引起NETs的產(chǎn)生。結(jié)論:在FlgE引起的急性肺損傷中,IL-17A通過(guò)肺組織促進(jìn)趨化因子(如CXCL1、CXCL2)的表達(dá)進(jìn)而募集中性粒細(xì)胞至炎癥部位,此過(guò)程受STAT3的調(diào)節(jié)。侵潤(rùn)的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs釋放。FlgE可直接刺激中性粒細(xì)胞表達(dá)IL-17A、上調(diào)STAT3的磷酸化水平。第三部分細(xì)胞膜表面ATP5B介導(dǎo)FlgE對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能目的:雖然綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE免疫調(diào)控功能已得到證實(shí),且此免疫活性可能由兩個(gè)關(guān)鍵肽段Be位點(diǎn)和Fe位點(diǎn)介導(dǎo)[1],然而細(xì)胞表面與其結(jié)合的分子并不清楚。課題組應(yīng)用親和Pull-down技術(shù),初步發(fā)現(xiàn)FlgE可與CAV1、ATP synthase、Rab5等細(xì)胞膜分子結(jié)合[1],然而,缺乏有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明這一推測(cè)。近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜表面表達(dá)的ATP合酶在能量代謝、炎癥反應(yīng)及腫瘤免疫等發(fā)面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)以HUVEC和SVEC細(xì)胞系為模型,探討其表面的ATP5B在FlgE識(shí)別及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用。方法:制備ATP5B蛋白的兔源性多克隆抗體(Pc ATP5BAb)流式檢測(cè)HUVEC和SVEC細(xì)胞膜表面ATP5B蛋白的表達(dá)。提取內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)胞膜蛋白,采用親和Pull-down技術(shù)檢測(cè)FlgE和FlgEM與ATP5B蛋白的結(jié)合。流式及ELISA法檢測(cè)FlgE、FlgEM、B肽段、F肽段與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面ATP5B蛋白或重組ATP5B蛋白的結(jié)合,Luminescence法檢測(cè)此過(guò)程中ECs表面ATP合酶活性的變化情況。通過(guò)細(xì)胞增殖(MTT法)、細(xì)胞遷移(細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn))、細(xì)胞凋亡(Annexin V-7AAD)、細(xì)胞通透性(FITC-Dextran)等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FlgE的刺激活性及細(xì)胞膜表面ATP5B蛋白經(jīng)抗體、B肽段或F肽段阻斷后對(duì)FlgE刺激活性的影響。q PCR和western blot方法檢測(cè)相關(guān)基因或蛋白的變化。結(jié)果:流式方法檢測(cè)到HUVEC和SVEC細(xì)胞膜表面有ATP5B蛋白的表達(dá),且ATP5B蛋白表達(dá)量與細(xì)胞的增值狀態(tài)相關(guān)。Pull-down結(jié)果可見(jiàn)FlgE,而不是FlgEM,與ECs細(xì)胞膜ATP5B蛋白結(jié)合。流式與ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雖然FlgEM亦可與ECs結(jié)合但其結(jié)合能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于FlgEM、Be短肽及Fe短肽,且后三者與ecto-ATP5B的結(jié)合可被Pc ATP5BAb特異性抑制。Be短肽及Fe短肽與重組ATP5B蛋白或ECs表面ATP5B蛋白的結(jié)合可被FlgE或Pc ATP5BAb競(jìng)爭(zhēng)性抑制。此外,Be短肽和Fe短肽還具有與Pc ATP5BAb相似的功能,與ECs細(xì)胞膜表面ATP5B亞基結(jié)合后能抑制其催化ADP轉(zhuǎn)化為ATP的活性,有趣的是,FlgE和FlgEM對(duì)ATP合酶活性影響不大。FlgE刺激可引起HUVEC和SVEC增殖減弱、遷移增加、凋亡增加、通透性增強(qiáng)等現(xiàn)象,而當(dāng)HUVEC和SVEC細(xì)胞經(jīng)Pc ATP5BAb封閉后可顯著減弱FlgE刺激引起的以上效應(yīng)。結(jié)論:重組FlgE蛋白通過(guò)Be和Fe位點(diǎn)與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的ATP5B蛋白結(jié)合從而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的一系列炎性改變。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【圖文】：

圖 1 FlgE 蛋白A）pET24-FlgE 質(zhì)粒模式圖；B）FlgE 蛋白瓊脂糖凝膠電泳圖；3.2 FlgE 誘導(dǎo) ALI 的一般檢測(cè)指標(biāo)FlgE 滴鼻 24 h 后，經(jīng)眶靜脈采血檢測(cè)外周血象發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組小鼠相比 F

FlgE 滴鼻 24 h 后，經(jīng)眶靜脈采血檢測(cè)外周血象發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組小鼠相比 FlgE滴鼻后外周血白細(xì)胞總數(shù)升高；進(jìn)一步對(duì)白細(xì)胞亞群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)增加的細(xì)胞主要為中性粒細(xì)胞（圖2A，B）。qPCR及 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示小鼠肺組織及 BALF中IL-1b、IL-6、IL-17A 表達(dá)水平升高（圖 2C，D）。HE 病理切片顯示 FlgE 滴鼻 24 h 后肺組織中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖 2E）。以上結(jié)果說(shuō)明細(xì)菌鞭毛鉤蛋白 FlgE 可作為獨(dú)立的細(xì)菌成分引起小鼠急性肺損傷。

圖 3：FlgE 誘導(dǎo) ALI 肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況及相關(guān)炎性因子表達(dá)水平小鼠中性粒細(xì)胞消除組，在 FlgE 滴鼻之前 24 h 預(yù)先經(jīng)腹腔注射 150 g/500nti-Ly6G/C 特異性抗體。A）FlgE 滴鼻 24 h 后用 1 mL PBS 灌洗小鼠肺組織獲得支肺泡灌洗液，并計(jì)數(shù)浸潤(rùn)的細(xì)胞數(shù)。根據(jù)細(xì)胞的特異膜表面分子標(biāo)記免疫細(xì)胞

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本文編號(hào)：2772300