【摘要】：第一部分細菌鞭毛鉤蛋白FlgE誘導急性肺損傷的免疫機制目的:微生物成分與免疫系統(tǒng)的相互作用是病-宿互作的重要內(nèi)容。但迄今為止,國內(nèi)外對細菌鞭毛鉤蛋白FlgE的免疫相關特性鮮有報道。課題組在之前研究中首次發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌鞭毛鉤蛋白FlgE具有顯著的免疫調(diào)控功能,FlgE刺激HCEC和肺組織切片可活化多條與炎癥、免疫反應相關的通路[1]。然而,FlgE作用機體后引起怎樣的免疫效應仍不清楚。本部分以小鼠急性肺損傷模型為研究對象,闡述由FlgE刺激所引起的急性炎癥的一般特點。方法:原核表達及純化FlgE蛋白并去內(nèi)毒素。FlgE(250mg/100mL)滴鼻建立小鼠急性肺損傷模型。觀察滴鼻后24 h小鼠肺部病變情況。流式分析肺組織中浸潤的免疫細胞的亞群及比例,同時檢測脾臟中免疫細胞的變化。q-PCR檢測肺組織中炎癥因子的基因表達水平。ELISA檢測小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF,Bronchoalveolar lavage fluid)中細胞因子的表達水平。熒光顯微鏡觀察肺組織NETs產(chǎn)生情況,并用DNA定量試劑盒檢測BALF中游離DNA的含量。另外,前期實驗初步證實肺上皮細胞膜表面表達的CAV1(Caveolin-1)蛋白為FlgE的可能配體之一[1],本實驗中分離CAV1基因敲除(Caveolin-1-/-)小鼠骨髓來源的中性粒細胞并給予FlgE刺激,q PCR檢測炎癥因子的表達。結(jié)果:成功制備去內(nèi)毒素的FlgE蛋白。FlgE滴鼻24 h后成功建立小鼠急性肺損傷模型。在FlgE誘導的急性肺損傷中,浸潤的免疫細胞主要是中性粒細胞,免疫消除中性粒細胞后炎癥減輕。FlgE刺激后小鼠肺組織和BALF中細胞因子(如IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-23、G-CSF)和中性粒細胞趨化因子(如CXCL1、CXCL2和CXCL5)的表達顯著升高。FlgE刺激后ROS+中性粒細胞比例升高,而中性粒細胞凋亡不明顯。此外,熒光顯微鏡下可見FlgE滴鼻后小鼠肺組織中有NETs樣結(jié)構存在,同時BALF中DNA含量顯著升高。然而,體外抑制中性粒細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生并不能阻斷其NETs的釋放。此外,q PCR結(jié)果顯示,CAV1基因缺失可顯著降低FlgE刺激引起的中性粒細胞內(nèi)炎癥因子(如IL-1b、IL-6、IL-17A、CXCL1、CXCL2)的表達。結(jié)論:FlgE刺激小鼠引起炎癥反應,其主要效應細胞是中性粒細胞。遷移到炎癥部位的中性粒細胞以NETs形式發(fā)揮作用。此外,中性粒細胞膜表面CAV1蛋白可能為FlgE的結(jié)合分子之一。第二部分IL-17A在細菌鞭毛鉤蛋白FlgE致炎活性中的作用目的:IL-17A是調(diào)節(jié)機體炎癥反應的一個關鍵細胞因子,由多種細胞分泌。初步研究發(fā)現(xiàn)在FlgE滴鼻建立的小鼠急性肺炎模型中IL-17A的基因和蛋白表達水平均升高。因此本部著重探討IL-17A的缺失對FlgE引起的急性炎癥的影響。方法:應用野生型(WT,wild-type)小鼠和IL-17A基因敲除(Il17a-/-)小鼠,FlgE(250mg/100mL)滴鼻建立小鼠急性肺損傷模型,滴鼻24 h后處死小鼠收樣檢測。從組織癥病變程度、免疫細胞細胞浸潤水平以及細胞因子表達及分泌三個方面比較IL-17A缺失對的FlgE引起的急性肺炎的影響。分離WT小鼠和Il17a-/-小鼠的肺組織,給予FlgE刺激,建立體外培養(yǎng)模型[1],western blot檢測FlgE刺激不同時間點肺組織中STAT3的磷酸化水平,transwell遷移實驗比較FlgE刺激后兩種小鼠肺-組織培養(yǎng)上清對中性粒細胞遷移和NETs形成的影響。Percoll密度梯度離心法分離野生型小鼠骨髓來源中性粒細胞,采用flow cyto、q PCR、western blot等方法檢測中性粒細胞在FlgE刺激下后其自身IL-17A的表達和STAT3的磷酸化水平。結(jié)果:與WT小鼠相比,FlgE滴鼻后Il17a-/-小鼠肺組織炎性病變及免疫細胞浸潤程度均明顯減低,而預先免疫消除中性粒細胞后,FlgE引起的炎癥反應程度在兩種小鼠中均減弱。當IL-17A缺失后,除IL-23無明顯差異外,來源于肺組織和BALF的細胞因子(如IL-1b、IL-6、G-CSF)和趨化因子(如CXCL1、CXCL2)的基因表達和蛋白分泌水平均顯著降低。western blot檢測FlgE刺激相同時間時肺組織切片中STAT3的磷酸化水平,發(fā)現(xiàn),Il17a-/-小鼠肺組織切片中STAT3的活化水平低于WT小鼠肺片的活化水平。盡管用FlgE與野生型小鼠或Il17a-/-小鼠的肺片共培養(yǎng)上清(刺激時間24 h)做趨化劑都可以顯著增加中性粒細胞遷移的數(shù)目,然而,當IL-17A缺失后此種趨化效應明顯低于正常小鼠的趨化效應。另外,肺片經(jīng)STAT3抑制劑預處理后其共培養(yǎng)上清趨化引起的中性粒細胞遷移數(shù)量減少。骨髓來源中性粒細胞在FlgE(5mg/m L、10mg/m L)刺激作用下IL-17A-IL-17RC的基因表達水平升高、STAT3的磷酸化程度增加。激光共聚焦顯微鏡下可見大量中性粒細胞核呈彌散網(wǎng)狀結(jié)構(NETs,neutrophil extracellular trap)附著于WT小鼠的肺組織,同時BALF中游離DNA含量以及血清中MPO含量均明顯升高,而IL-17A缺失后中性粒細胞核多呈典型分葉結(jié)構且DNA和MPO檢出量亦遠低于WT小鼠的含量。FlgE與WT小鼠肺組織共培養(yǎng)上清亦可引起明顯的NETs釋放現(xiàn)象,而IL-17A缺失后此種效應減弱。另外,FlgE單獨刺激中性粒細胞可引起NETs釋放,而IL-17A單獨作用并不能引起NETs的產(chǎn)生。結(jié)論:在FlgE引起的急性肺損傷中,IL-17A通過肺組織促進趨化因子(如CXCL1、CXCL2)的表達進而募集中性粒細胞至炎癥部位,此過程受STAT3的調(diào)節(jié)。侵潤的中性粒細胞產(chǎn)生NETs釋放。FlgE可直接刺激中性粒細胞表達IL-17A、上調(diào)STAT3的磷酸化水平。第三部分細胞膜表面ATP5B介導FlgE對血管內(nèi)皮細胞的調(diào)節(jié)功能目的:雖然綠膿桿菌鞭毛鉤蛋白FlgE免疫調(diào)控功能已得到證實,且此免疫活性可能由兩個關鍵肽段Be位點和Fe位點介導[1],然而細胞表面與其結(jié)合的分子并不清楚。課題組應用親和Pull-down技術,初步發(fā)現(xiàn)FlgE可與CAV1、ATP synthase、Rab5等細胞膜分子結(jié)合[1],然而,缺乏有力的實驗數(shù)據(jù)證明這一推測。近年研究發(fā)現(xiàn)細胞膜表面表達的ATP合酶在能量代謝、炎癥反應及腫瘤免疫等發(fā)面發(fā)揮重要作用。本實驗以HUVEC和SVEC細胞系為模型,探討其表面的ATP5B在FlgE識別及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞生物學功能中的作用。方法:制備ATP5B蛋白的兔源性多克隆抗體(Pc ATP5BAb)流式檢測HUVEC和SVEC細胞膜表面ATP5B蛋白的表達。提取內(nèi)皮細胞(ECs)胞膜蛋白,采用親和Pull-down技術檢測FlgE和FlgEM與ATP5B蛋白的結(jié)合。流式及ELISA法檢測FlgE、FlgEM、B肽段、F肽段與內(nèi)皮細胞膜表面ATP5B蛋白或重組ATP5B蛋白的結(jié)合,Luminescence法檢測此過程中ECs表面ATP合酶活性的變化情況。通過細胞增殖(MTT法)、細胞遷移(細胞劃痕實驗)、細胞凋亡(Annexin V-7AAD)、細胞通透性(FITC-Dextran)等實驗檢測FlgE的刺激活性及細胞膜表面ATP5B蛋白經(jīng)抗體、B肽段或F肽段阻斷后對FlgE刺激活性的影響。q PCR和western blot方法檢測相關基因或蛋白的變化。結(jié)果:流式方法檢測到HUVEC和SVEC細胞膜表面有ATP5B蛋白的表達,且ATP5B蛋白表達量與細胞的增值狀態(tài)相關。Pull-down結(jié)果可見FlgE,而不是FlgEM,與ECs細胞膜ATP5B蛋白結(jié)合。流式與ELISA檢測發(fā)現(xiàn)雖然FlgEM亦可與ECs結(jié)合但其結(jié)合能力遠遠低于FlgEM、Be短肽及Fe短肽,且后三者與ecto-ATP5B的結(jié)合可被Pc ATP5BAb特異性抑制。Be短肽及Fe短肽與重組ATP5B蛋白或ECs表面ATP5B蛋白的結(jié)合可被FlgE或Pc ATP5BAb競爭性抑制。此外,Be短肽和Fe短肽還具有與Pc ATP5BAb相似的功能,與ECs細胞膜表面ATP5B亞基結(jié)合后能抑制其催化ADP轉(zhuǎn)化為ATP的活性,有趣的是,FlgE和FlgEM對ATP合酶活性影響不大。FlgE刺激可引起HUVEC和SVEC增殖減弱、遷移增加、凋亡增加、通透性增強等現(xiàn)象,而當HUVEC和SVEC細胞經(jīng)Pc ATP5BAb封閉后可顯著減弱FlgE刺激引起的以上效應。結(jié)論:重組FlgE蛋白通過Be和Fe位點與內(nèi)皮細胞膜表面的ATP5B蛋白結(jié)合從而介導內(nèi)皮細胞的一系列炎性改變。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R378
【圖文】：

圖 1 FlgE 蛋白A）pET24-FlgE 質(zhì)粒模式圖；B）FlgE 蛋白瓊脂糖凝膠電泳圖；3.2 FlgE 誘導 ALI 的一般檢測指標FlgE 滴鼻 24 h 后，經(jīng)眶靜脈采血檢測外周血象發(fā)現(xiàn)與正常對照組小鼠相比 F

FlgE 滴鼻 24 h 后，經(jīng)眶靜脈采血檢測外周血象發(fā)現(xiàn)與正常對照組小鼠相比 FlgE滴鼻后外周血白細胞總數(shù)升高；進一步對白細胞亞群進行分析，發(fā)現(xiàn)增加的細胞主要為中性粒細胞（圖2A，B）。qPCR及 ELISA檢測結(jié)果顯示小鼠肺組織及 BALF中IL-1b、IL-6、IL-17A 表達水平升高（圖 2C，D）。HE 病理切片顯示 FlgE 滴鼻 24 h 后肺組織中有大量炎性細胞浸潤（圖 2E）。以上結(jié)果說明細菌鞭毛鉤蛋白 FlgE 可作為獨立的細菌成分引起小鼠急性肺損傷。

圖 3：FlgE 誘導 ALI 肺組織中炎性細胞浸潤情況及相關炎性因子表達水平小鼠中性粒細胞消除組，在 FlgE 滴鼻之前 24 h 預先經(jīng)腹腔注射 150 g/500nti-Ly6G/C 特異性抗體。A）FlgE 滴鼻 24 h 后用 1 mL PBS 灌洗小鼠肺組織獲得支肺泡灌洗液，并計數(shù)浸潤的細胞數(shù)。根據(jù)細胞的特異膜表面分子標記免疫細胞

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本文編號：2772300