【摘要】：越來越多的研究表明,炎癥性損傷是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如抑郁癥、阿爾茨海默病等的重要發(fā)病機(jī)制。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為經(jīng)典的炎癥刺激因子,它與受體結(jié)合后啟動一系列的磷酸化過程,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子-κB(transcription factor-κB,NF-κB)進(jìn)入細(xì)胞核釋放大量的炎癥因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素6(interleukin 6,IL-6)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素10(interleukin 10,IL-10)等。最近的一項(xiàng)研究表明,子宮內(nèi)暴露于感染/炎癥的后代患自閉癥的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。推測孕期暴露炎癥可能會增加子代大鼠腦損傷易感性,但具體機(jī)制仍然未知。眾所周知,COX2在炎癥相關(guān)性疾病中扮演了重要角色�；ㄉ南┧嵬ㄟ^COX氧化后產(chǎn)生的所有PGs中,前列腺素D2(prostaglandin D2,PGD2)是人體腦中含量最豐富的前列腺素。PGD2通過前列腺素D1受體(prostaglandin D1 receptor,DP1)和前列腺素D2受體(prostaglandin D2 receptor,DP2)在各種生理和病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。本研究主要觀察孕期炎癥對子代大鼠LPS致腦損傷易感性的影響,并從COX2-PGD2-DPs途徑初步探討其機(jī)制。第一部分孕期炎癥對LPS致子代成年大鼠腦損傷的影響目的:觀察孕期炎癥刺激對LPS致子代成年大鼠腦損傷的影響,以及大鼠腦組織COX2-PGD2-DPs途徑變化特征;通過COX2干預(yù)初步明確COX2-PGD2-DPs途徑與孕期炎癥影響子代成年大鼠對LPS腦損傷易感性的相關(guān)性。方法:1.孕期炎癥模型的建立通過檢查陰栓獲得準(zhǔn)確妊娠時間(見陰栓當(dāng)天為孕齡第1天)的孕鼠雌性SD大鼠,30只孕鼠于妊娠期第11、14和18天分別給予腹腔注射300μg/kgLPS(n=21)或等體積無菌生理鹽水(normal saline,NS)(n=9),子代大鼠,由孕鼠繁殖。在4周齡時各組子代大鼠斷乳,雌雄分籠飼養(yǎng)。2.子代大鼠LPS誘導(dǎo)腦損傷模型的建立孕期LPS或NS處理的子代大鼠在第60天時隨機(jī)選取70只雄鼠用于該實(shí)驗(yàn)造模,雙側(cè)側(cè)腦室各注射5μl LPS(12μg/μl)或等體積人工腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)。3.實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分7組:正常對照組(NS+CSF)、產(chǎn)前炎癥組(LPS+CSF)、產(chǎn)后炎癥組(NS+LPS)、產(chǎn)前產(chǎn)后炎癥雙刺激組(LPS+LPS)、產(chǎn)前炎癥+美洛昔康(meloxicam,MXC)組(LPS+CSF+MXC)、產(chǎn)后炎癥+MXC組(NS+LPS+MXC)和產(chǎn)前產(chǎn)后炎癥雙刺激+MXC組(LPS+LPS+MXC),n=10。造模后第二天開始連續(xù)一周灌胃給予3mg/kg美洛昔康,其余組給予等體積0.5%CMC。4.主要觀察指標(biāo)及方法采用水迷宮實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)和自發(fā)活動測試,檢測子代大鼠行為學(xué)改變情況;采用HE染色,觀察海馬及皮層病理學(xué)改變;ELISA法檢測大鼠海馬及皮層中PGD2、IL-6、TNF-α、IL-1β的含量;生化酶學(xué)方法檢測大鼠海馬及皮層中SOD活性及MDA含量;Western blot檢測APP、Aβ、COX2、DP1和DP2蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.與NS+CSF組相比,LPS+CSF組大鼠尋臺潛伏期延長,穿梭平臺次數(shù)減少,探究行為及自發(fā)運(yùn)動活動減少;皮層及海馬神經(jīng)元有少量的核深染/固縮;皮層PGD2和TNF-α的含量明顯升高;海馬IL-6和IL-1β的含量明顯升高;皮層MDA含量顯著增加、皮層及海馬SOD活性顯著下降;皮層Aβ、COX2、DP2蛋白表達(dá)明顯升高,DP1蛋白表達(dá)明顯降低;海馬APP、Aβ和COX2蛋白表達(dá)明顯升高;而大鼠皮層IL-1β、IL-6含量和APP蛋白表達(dá)無顯著性差異,海馬TNF-α、PGD2、MDA水平和DP1、DP2蛋白表達(dá)無顯著性差異。2.與NS+CSF組相比,NS+LPS和LPS+LPS組大鼠尋臺潛伏期延長,穿梭平臺次數(shù)減少,探究行為及自發(fā)運(yùn)動活動減少;皮層及海馬神經(jīng)元有明顯的核固縮/深染;皮層及海馬PGD2、IL-6、IL-1β的含量明顯升高;MDA含量顯著增加、SOD活性顯著下降;APP、Aβ、COX2、DP2蛋白表達(dá)明顯升高,DP1蛋白表達(dá)明顯降低;而NS+CSF組與NS+LPS組間大鼠海馬TNF-α無顯著性差異。3.與NS+LPS組相比,LPS+LPS組大鼠尋臺潛伏期延長,穿梭平臺次數(shù)減少,水平運(yùn)動及自發(fā)運(yùn)動活動減少;皮層及海馬神經(jīng)元有明顯的核固縮/深染;皮層IL-6和IL-1β的含量明顯升高,海馬PGD2和IL-6含量明顯升高;海馬MDA含量顯著增加;皮層及海馬SOD活性顯著下降、APP、Aβ、COX2和DP2蛋白表達(dá)明顯升高,DP1蛋白表達(dá)明顯降低;而皮層PGD2、TNF-α和MDA水平無顯著性差異,海馬IL-1β和TNF-α水平無顯著性差異。4.與LPS+LPS組相比,LPS+LPS+MXC組大鼠尋臺潛伏期縮短,穿梭平臺次數(shù)增加,探索行為及自發(fā)運(yùn)動活動增加;皮層及海馬核固縮、深染減少,皮層IL-6、TNF-α和IL-1β的含量明顯降低;海馬PGD2和IL-6的含量明顯降低;皮層及海馬SOD活性顯著上升、皮層MDA含量顯著降低;皮層Aβ、COX2和DP2蛋白表達(dá)明顯降低;海馬APP、Aβ、COX2和DP2蛋白表達(dá)明顯降低,DP1蛋白表達(dá)明顯增加;而大鼠皮層PGD2水平和DP1、APP蛋白表達(dá)無顯著性差異,海馬MDA、TNF-α、IL-1β水平無顯著性差異。結(jié)論:1.孕期炎癥刺激可引起子代成年大鼠行為和病理異常。2.孕期炎癥刺激可引起子代大鼠皮層COX2表達(dá)增加,DP2表達(dá)增加,而DP1表達(dá)降低。3.孕期炎癥刺激可增加子代大鼠成年后對LPS誘導(dǎo)腦損傷易感性;其機(jī)制可能與COX2-PGD2-DPs平衡失調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng),增加Aβ和APP蛋白表達(dá)有關(guān)。4.美洛昔康對LPS致孕期炎癥刺激子代大鼠腦損傷有明顯的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與抑制COX2活性,重建COX2-PGD2-DPs平衡,進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)有關(guān)。第二部分孕期炎癥對LPS致子代大鼠原代神經(jīng)元損傷的影響目的:觀察孕期炎癥刺激子代大鼠原代神經(jīng)元對LPS致神經(jīng)元損傷的易感性,并從COX2-PGD2-DPs途徑初步探討其機(jī)制。方法:1.SD大鼠原代神經(jīng)元培養(yǎng)及LPS誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷模型的建立(1)通過檢查陰栓獲得準(zhǔn)確妊娠時間(見陰栓當(dāng)天為孕齡第1天)的孕鼠雌性SD大鼠,孕鼠于妊娠期第11、14和18天給予腹腔注射300μg/kgLPS或等體積無菌生理鹽水NS。(2)選取24h內(nèi)新生乳鼠,離體培養(yǎng)原代神經(jīng)元,神經(jīng)元培養(yǎng)至第7天,特異性烯醇化酶鑒定神經(jīng)元;MTT法測定給藥后細(xì)胞存活率,試劑盒測定LDH漏出率,確定LPS致神經(jīng)元損傷的最適濃度和時間點(diǎn)。2.COX2干預(yù)對LPS致孕期炎癥子代大鼠原代神經(jīng)元損傷的影響(1)采用正常(非孕期炎癥處理)原代培養(yǎng)神經(jīng)元,以及LPS致正常原代神經(jīng)元損傷模型,以MTT法測定給藥后細(xì)胞存活率,生化酶法測定細(xì)胞LDH漏出率,確定COX2抑制劑MXC有效濃度。(2)實(shí)驗(yàn)分組及觀察指標(biāo)分為7組:NS、LPS、NS+LPS、LPS+LPS、LPS+MXC、NS+LPS+MXC和LPS+LPS+MXC組,n=6。其中,NS組為孕期不給予炎癥刺激;LPS組為孕期炎癥子代大鼠原代神經(jīng)元;NS+LPS組為孕期正常子代給予LPS;LPS+LPS組為孕期炎癥+子代給予LPS雙刺激。觀察指標(biāo)及方法:MTT法測定給藥后細(xì)胞存活率,生化酶法測定細(xì)胞LDH漏出率;ELISA檢測神經(jīng)元PGD2、IL-6、TNF-α、IL-1β的含量;生化酶學(xué)檢測神經(jīng)元SOD活性及MDA含量;流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡;Western blot檢測神經(jīng)元APP、Aβ、COX2、DP1和DP2蛋白表達(dá)。3.DPs干預(yù)對LPS致孕期炎癥子代大鼠原代神經(jīng)元損傷的影響(1)采用正常(非孕期炎癥處理)原代培養(yǎng)神經(jīng)元,以及LPS致正常原代神經(jīng)元損傷模型,以MTT法測定細(xì)胞存活率,生化酶法測定細(xì)胞LDH漏出率,確定DP1激動劑(BW245C),DP1拮抗劑(BWA868C),DP2激動劑(DK-PGD2)和DP2拮抗劑(AZD1981)的有效濃度。(2)實(shí)驗(yàn)分組及觀察指標(biāo)分為7組:NS、LPS、NS+LPS、LPS+LPS、LPS+藥物、NS+LPS+藥物和LPS+LPS+藥物組。藥物分別為:DP1激動劑(BW245C),DP1拮抗劑(BWA868C),DP2激動劑(DK-PGD2)和DP2拮抗劑(AZD1981),n=6。觀察指標(biāo)及方法:MTT法測定給藥后各組神經(jīng)元存活率,生化酶法測定各組神經(jīng)元LDH漏出率,流式細(xì)胞術(shù)測定各組神經(jīng)元凋亡。結(jié)果:1.1μg/ml LPS作用于神經(jīng)元24h,細(xì)胞存活率明顯下降,而LDH漏出率明顯增加。2.COX2干預(yù)對LPS致孕期炎癥子代大鼠原代神經(jīng)元損傷的影響(1)與NS+LPS組相比,1×10~(-8)M MXC給藥后能夠顯著提高LPS損傷神經(jīng)元存活率,降低LDH漏出率,因此選擇1×10~(-8)MMXC作為有效給藥濃度。(2)與NS組相比,LPS組大鼠原代神經(jīng)元MTT值明顯降低;LDH漏出率明顯升高;細(xì)胞凋亡增加;PGD2、TNF-α、IL-1β的含量明顯升高;MDA含量顯著增加、SOD活性顯著下降;APP、Aβ、COX2和DP2蛋白表達(dá)水平顯著增加;而DP1蛋白表達(dá)和IL-6含量無顯著性差異。與NS組相比,NS+LPS和LPS+LPS組大鼠神經(jīng)元MTT值明顯降低;LDH漏出率明顯升高;細(xì)胞凋亡增加;PGD2、IL-6、TNF-α、IL-1β的含量明顯升高;MDA含量顯著增加、SOD活性顯著下降;APP、Aβ、COX2、DP1和DP2的蛋白表達(dá)水平顯著增加。與NS+LPS組相比,LPS+LPS組大鼠神經(jīng)元MTT值明顯降低;LDH漏出率明顯升高;細(xì)胞凋亡增加;SOD活性顯著下降;APP、COX2、DP1和DP2的蛋白表達(dá)水平顯著增加;而PGD2、IL-6、TNF-α、IL-1β和MDA含量和Aβ蛋白表達(dá)無明顯差異。與LPS+LPS組相比,LPS+LPS+MXC組原代神經(jīng)元MTT值明顯升高;LDH漏出率明顯降低;細(xì)胞凋亡減少;SOD活性顯著上升;APP、Aβ、COX2和DP2的蛋白表達(dá)水平顯著下降;而PGD2、IL-6、TNF-α、IL-1β及MDA含量和DP1蛋白表達(dá)無顯著性差異。3.DPs干預(yù)對LPS致孕期炎癥子代大鼠原代神經(jīng)元損傷的影響(1)與NS+LPS組相比,1×10~(-5) M DP1激動劑(BW245C)或1×10~(-5) MDP2拮抗劑(AZD1981)給藥后能夠顯著提高LPS處理神經(jīng)元存活率,降低LDH漏出率,因此選擇1×10~(-5) M作為最佳給藥濃度。與NS+LPS組相比,1×10~(-5) M DP1拮抗劑(BWA868C)或1×10~(-5) MDP2激動劑(DK-PGD2)給藥后能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元存活率,增加LDH漏出率,因此選擇1×10~(-5) M作為最佳給藥濃度。(2)與LPS+LPS處理相比,給予DP1激動劑(BW245C)或DP2拮抗劑(AZD1981)干預(yù)后,神經(jīng)元存活率顯著升高,LDH漏出率顯著降低和細(xì)胞凋亡減少;而給予DP1拮抗劑(BWA868C)或DP2激動劑(DK-PGD2)干預(yù)后,神經(jīng)元存活率顯著降低,LDH漏出率顯著升高,細(xì)胞凋亡增加。結(jié)論:1.孕期炎癥子代大鼠原代神經(jīng)元存活率下降、LDH漏出率增加,細(xì)胞凋亡增加;神經(jīng)元COX2表達(dá)及下游產(chǎn)物表達(dá)明顯增加。2.孕期炎癥刺激增加子代神經(jīng)元對LPS損傷的易感性。3.孕期炎癥刺激增加子代神經(jīng)元對LPS損傷易感性的機(jī)制可能涉及COX2-PGD2-DPs途徑平衡失調(diào)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R363
【圖文】：

組織及器官有明顯異常。因此，當(dāng)給藥完成時，每組中至少有9只大鼠。2.3 孕期炎癥刺激對 LPS 處理子代大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響如圖1a所示，與NS+CSF組相比，LPS+CSF、NS+LPS和LPS+LPS組大鼠逃避潛伏期明顯延長（P <0.05和P <0.01）。LPS+LPS組大鼠逃避潛伏期比NS+LPS組（P<0.05）和LPS+CSF組（P<0.05）明顯延長。與LPS+CSF組大鼠相比，LPS+CSF+MXC組逃避潛伏期顯著縮短（P<0.05）。與NS+LPS組大鼠相比，

曠場實(shí)驗(yàn)是研究嚙齒動物的探索行為和自發(fā)運(yùn)動活動的公認(rèn)行為學(xué)工具。與NS+CSF組相比，LPS+CSF、NS+LPS和LPS+LPS組大鼠垂直運(yùn)動，水平運(yùn)動明顯減少（P <0.05和P <0.01）（圖2）；其中LPS+CSF組大鼠理毛次數(shù)和排泄次數(shù)沒有顯著變化；NS+LPS組大鼠理毛次數(shù)無顯著差異。此外，與NS+LPS組相比，LPS+LPS組大鼠水平運(yùn)動明顯減少（P＜0.05）；但對于理毛次數(shù)，垂直運(yùn)動和排泄次數(shù)沒有顯著影響。與LPS+CSF組相比，LPS+CSF+MXC組大鼠水平運(yùn)動、

P<0.01vs.LPS+LPS group.2.5 孕期炎癥刺激對 LPS 處理子代大鼠自發(fā)活動的影響大鼠自發(fā)活動測試結(jié)果顯示（圖3），與NS+CSF組相比，LPS+CSF、NS+LPS和LPS+LPS組大鼠自發(fā)運(yùn)動次數(shù)顯著減少（P <0.05和P <0.01）。與LPS+CSF組相比，NS+LPS和LPS+LPS組大鼠自發(fā)活動次數(shù)明顯減少（P <0.05和P <0.01）。另外，與NS+LPS組相比，LPS+LPS組大鼠自發(fā)活動次數(shù)顯著減少(P＜0.05)。LPS+CSF組與LPS+CSF+MXC組間大鼠自發(fā)活動次數(shù)無明顯差異。與NS+LPS組相比，NS+LPS+MXC組大鼠自發(fā)活動次數(shù)有增加趨勢，但無顯著性差異。與LPS+LPS組相比

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 宋歌;呂月濤;狄林林;宗文納;陳伯旺;;早期腸內(nèi)營養(yǎng)對重癥肺炎大鼠免疫功能的影響分析[J];中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版);2017年01期

2 葉敏;陳達(dá)柔;陳宇中;杜少冰;杜展鑫;李玉鳳;唐s鉈

本文編號：2772093