【摘要】：神經(jīng)系統(tǒng)參與動(dòng)物意識(shí)與行為的調(diào)控,對個(gè)體的心理、生理和行為能力都起著十分重要的作用。神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育一旦出現(xiàn)障礙往往會(huì)引發(fā)多種神經(jīng)類疾病。通過對這類疾病的研究,可以為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育機(jī)制的探究提供線索與指示。既往研究發(fā)現(xiàn)BRWD3(bromodomain and WD repeat domain containing 3)基因與神經(jīng)精神類疾病(如:智力發(fā)育障礙(intellectual developmental disorder,IDD)的發(fā)生顯著相關(guān),但是BRWD3基因是否影響個(gè)體神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,以及其具體的發(fā)生機(jī)制尚不明確。BRWD3作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,該蛋白質(zhì)由WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域(WD40 repeat,WDR)和bromodomain(Brd)結(jié)構(gòu)域組成,它廣泛分布于人體各個(gè)器官,而且在腦部具有較高表達(dá)。BRWD3蛋白通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用,一方面可轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多個(gè)目標(biāo)基因,另一方面還可通過乙�；糜脜⑴c染色質(zhì)修飾。通過前期的研究和文獻(xiàn)追蹤,并結(jié)合疾病的致病特征,我們推測BRWD3基因可能是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控下游神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因,從而影響機(jī)體的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育發(fā)生。本研究旨在探究BRWD3究竟是參與哪些基因的表達(dá)調(diào)控從而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,并為基因與疾病之間存在的作用機(jī)制提供線索。本研究利用Morpholino的方法,對斑馬魚的brwd3基因進(jìn)行誘變,然后選擇斑馬魚胚胎發(fā)育的10-體節(jié)期(segmentation 10 somites,10s)時(shí)期胚胎做為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育研究材料,利用轉(zhuǎn)錄組測序方法檢測并篩選實(shí)驗(yàn)組和對照組中受brwd3影響的表達(dá)差異基因,并在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建出brwd3作用于斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組分析基礎(chǔ)上,本研究對基因組選擇、差異表達(dá)閾值調(diào)整和差異基因篩選等環(huán)節(jié)進(jìn)行了調(diào)整,并結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)挖掘手段,推測受brwd3轉(zhuǎn)錄調(diào)控目標(biāo)基因,并通過網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建研究brwd3在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的調(diào)控作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果:1)通過RNA-Seq分析共得到基因25118個(gè),其中陽性表達(dá)基因16879個(gè)。其中在斑馬魚胚胎時(shí)期腦中表達(dá)基因7574個(gè),利用|log2FC|≥1和FDR≤0.05的差異表達(dá)基因(DEGs)的原則,篩選出差異表達(dá)基因474個(gè),上調(diào)基因182個(gè),下調(diào)基因292個(gè)。2)對上述DEGs進(jìn)行GO功能富集分析,找出與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的3個(gè)生物學(xué)功能條目:“sensory organ development(P=3.27E-03)”、“nervous system development(P=2.65E-06)”、“neuron differentiation(P=2.16E-03)”及其中包含DEGs 65個(gè);隨后對結(jié)合這些基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)分析及KEGG通路富集分析,推測有23個(gè)基因可能是受brwd3基因調(diào)控的下游基因,而且這些基因與“Wnt signaling pathway,Wnt”信號(hào)通路密切相關(guān),此分析結(jié)果為后續(xù)構(gòu)建brwd3基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供重要依據(jù)。3)結(jié)合String等數(shù)據(jù)庫信息,我們構(gòu)建出了brwd3基因影響斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,brwd3反向調(diào)控fzd8a表達(dá)升高從而激活Wnt信號(hào)通路后調(diào)節(jié)下游靶基因,從而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。且我們構(gòu)建的這個(gè)brwd3作用網(wǎng)絡(luò)也在qPCR隨機(jī)檢測和網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)基因的檢測中得到印證(R=0.89,P=3e-06)。隨后,我們所構(gòu)建的BRWD3作用網(wǎng)絡(luò)在2個(gè)細(xì)胞系中同樣也得到的驗(yàn)證。當(dāng)利用RNAi干涉技術(shù)影響2個(gè)細(xì)胞系(SH-SY5Y、MCF-7)的BRWD3基因表達(dá)后,網(wǎng)絡(luò)中的4個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)水平隨之發(fā)生相應(yīng)變化,而且這些基因的表達(dá)水平變化與本研究所構(gòu)建的brwd3調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相吻合。本研究利用斑馬魚模型探索了brwd3基因影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機(jī)制,同時(shí)構(gòu)建出了該基因作用于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的作用網(wǎng)絡(luò),為BRWD3基因表達(dá)變化從而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的分子機(jī)制提供了線索,但是該brwd3-fazd8a-Wnt作用網(wǎng)絡(luò)中,基因間的相互作用機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)行深度的研究與挖掘。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R346
【圖文】：

6圖 1-2 BRWD3 基因在各組織中的分布情況附注：橫坐標(biāo)為組織樣本類型，縱坐標(biāo)為 BRWD3 表達(dá)量。1.2.2 BRWD3 的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能對于 BRWD3 基因及其編碼產(chǎn)物尚無功能研究報(bào)道。BRWD3 中的 WD40 結(jié)構(gòu)域由 40 個(gè)氨基酸序列組成，其主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間相互作用[15]，具有 WD40 結(jié)構(gòu)域的蛋白參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄或者 RNA 加工、細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡以及信號(hào)傳導(dǎo)等[16]。在現(xiàn)階段的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種由于 WDR 蛋白的獲得性缺陷而導(dǎo)致的腦神經(jīng)性疾病，如，LIS1 基因是第一個(gè)被確認(rèn)與人類疾病發(fā)生相關(guān)的 WD-repeat 基因，LIS1 基因位點(diǎn)的缺失或突變，都有可能導(dǎo)致先天性無腦回�。↙issencephaly）的發(fā)生[17]，有研究就在孤立性腦無回序列（isolated lissencephaly sequence ，ILS）中發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變（c.446A>G, p.His148Arg）[18]，最終導(dǎo)致先天性無腦回病的發(fā)生，此外，

圖 2-1 顯微胚胎注射圖取加 300 μlβ-巰基乙醇的裂解液后，將胚胎組科技有限公司提供的動(dòng)物組織總 RNA 提取試作說明，提取胚胎總 RNA。及濃度定量主要包括：在瓊脂糖凝膠上對 RNA 進(jìn)行電260/230 等）檢測、利用 Agilent 2100 精確檢確定量等。及測序質(zhì)量評估據(jù)不同文庫的效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量需求進(jìn)最終的測序結(jié)果的質(zhì)量進(jìn)行評估檢測（該項(xiàng)工

2 瓊脂糖電泳初步檢測 RNA 提�。簃arker、野生型總 RNA、實(shí) 6 個(gè)樣品總 RNA 質(zhì)量檢測結(jié)果基因的表達(dá)定量容包括：對低質(zhì)量測序數(shù)據(jù)濃度(ng/μL)體積(μL)OD260/224 47 1.8226 47 1.7618 47 1.8337 47 1.8332 47 1.7937 47 1.78

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本文編號(hào)：2772009