【摘要】：A型流感病毒(IAV)是囊膜型的,分節(jié)段的,負(fù)鏈RNA病毒,屬于正黏病毒科,流感病毒屬。A型流感病毒由8個(gè)基因片段組成,每個(gè)基因片段編碼至少一種蛋白質(zhì)。迄今為止,IAV可編碼13種病毒蛋白。基于病毒表面蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原差異,可將IAV分為18個(gè)HA和11個(gè)NA亞型。近年來,跨越動(dòng)物—人類宿主物種屏障的A型流感病毒的病毒數(shù)量愈來愈多,給人類健康帶來嚴(yán)重威脅。目前,流感病毒疫苗是預(yù)防流感病毒的有效方法,特別是應(yīng)對季節(jié)性流感的重要手段。然而,流感病毒的主要抗原血凝素(HA)易發(fā)生基因突變,當(dāng)疫苗毒株與流行毒株不匹配時(shí),增加了流感病毒在人間傳播流行的風(fēng)險(xiǎn)。因此,A型流感病毒通用VLPs疫苗與通用抗體的研究,對于應(yīng)對抗原漂移變異后的流感病毒在人、動(dòng)物間的流行具有重要意義。一、通用型流感病毒疫苗的研究方向主要有以下幾個(gè):血凝素HA莖部蛋白;膜蛋白M2離子通道的胞外域蛋白(M2e);內(nèi)部核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M1)。本研究選擇高致病性禽流感病毒H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(SH-lclade 2.3.2.1;group 1)的 HA 莖部蛋白(HA Stem Protein,HLHA)、核蛋白(Nuclear protein,NP)、基質(zhì)蛋白(Matrix Protein,M1)和A型流感病毒的融合蛋白5M2e(2個(gè)人源、1個(gè)豬源和2個(gè)禽源),及融合蛋白HL5M2e(5M2e嵌合入HLHA以替補(bǔ)HA頭部的位置)為靶抗原,通過昆蟲—桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來構(gòu)建和制備AIV VLPs,并對其進(jìn)行免疫原性研究。通過滴鼻途徑免疫小鼠,3種AIV VLPs對BALB/c小鼠呈現(xiàn)出80%-90%不等的保護(hù)率。所有數(shù)據(jù)顯示,HL5M2e VLPs的免疫原性最好。因此,以HL5M2e VLPs為基礎(chǔ)開發(fā)通用型AIV疫苗具有潛在的發(fā)展空間。二、考慮到免疫接種的疫苗應(yīng)以能夠誘導(dǎo)小鼠的黏膜免疫為主,使小鼠能夠獲得足夠的黏膜免疫抗體sIgA,做好第一道防線。基于此,在HL5M2e VLPs的基礎(chǔ)上,又拯救了表達(dá)黏膜佐劑融合蛋白 glycosylphosphatidylinositol-anchored CCL28(GPI-CCL28)和 glycosylphosphatidylinositol-anchored GM-CSF(GPI-GM-CSF)基因的重組桿狀病毒,制備出嵌合型AIV cVLPs(CCL28 cVLPs、GM-CSF cVLPs和CCL28/GM-CSF cVLPs)。與 AIV 病毒樣顆粒 HL5M2e VLPs(含 HL5M2e、NP 和Ml)相比,可保護(hù)BALB/c小鼠對不同亞型的A型流感病毒的攻擊呈現(xiàn)不同的存活率:同源 H5N1 A/meerkat/Shanghai/SH-1/2012(SH-1;clade 2.3.2.1;group 1)可達(dá)100%;異源鼠適應(yīng)株H1N1 A/Changchun/01/2009(group 1)可達(dá)50%-60%;異源鼠適應(yīng)株 H3N2 A/baikal teal/Shanghai/SH-89/2013(group 2)可達(dá) 40-50%和異源鼠適應(yīng)株 H7N7 A/Lesser White-fronted goose/HuNan/412/2010(group 2)可達(dá) 10-20%。通過滴鼻免疫結(jié)果顯示,嵌合了 CCL28和GM-CSF的嵌合型AIV cVLPs可作為一種具有交叉保護(hù)活性的A型流感病毒疫苗候選株,為研發(fā)能夠針對不同亞型A型流感病毒的通用型流感疫苗奠定實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。三、對3株A型流感病毒通用型人源化抗體F10、H98和H40進(jìn)行了構(gòu)建和表達(dá),以及體外血凝抑制活性和中和活性的鑒定。結(jié)果顯示,人源化mAb Fl0比其它兩種人源化mAb具有更高的中和滴度和更寬的中和范圍,可作為用于構(gòu)建隨機(jī)突變抗體庫的基礎(chǔ)抗體,為接下來的抗體篩選工作奠定了實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｉｎｆｌｕｅｎｚａ邋Ａ邋ｖｉｒｕｓｆ３７］逡逑１．邋３流感的流行病學(xué)逡逑自１９９６年以來，據(jù)報(bào)道有超過１４種Ａ型流感病毒亞型引起人類感染（圖１．邋２）。逡逑大多數(shù)引起人類感染的流感亞型來自禽類，而只有少數(shù)來自豬，包括Ａ型流感病毒逡逑（Ｈ１Ｎ１）邋ｐｄｍ０９，邋Ａ型流感病毒（Ｈ１Ｎ１）邋ｖ和Ａ型流感病毒（Ｈ３Ｎ２）邋ｖ［３８－４３］。過逡逑去三年的期間，特別是在中國，更多亞型的Ａ型流感病毒己跨越物種障礙而引起人逡逑類感染的病例比以往任何時(shí)候都更多，活禽市場更為嚴(yán)重。大多數(shù)Ａ型流感病毒僅逡逑在人類中引起零星或小群感染。在迄今為止報(bào)告的所有Ａ型流感病毒中，Ａ型流感逡逑病毒Ｈ１Ｎ１邋ｐｄｍ０９，Ａ型流感病毒Ｈ５Ｎ１和Ａ型流感病毒Ｈ７Ｎ９己被證實(shí)在人類中逡逑可引起大規(guī)模爆發(fā)，并導(dǎo)致升高的死亡率和發(fā)病率。Ａ型流感病毒（Ｈ１Ｎ１）邋ｐｄｍ０９逡逑于２００９年出現(xiàn)并引起全球大流行

流感疫苗制備方法，如ＤＮＡ疫苗，病毒載體疫苗，病毒樣顆粒疫苗，細(xì)胞培養(yǎng)技逡逑術(shù)疫苗，重組ＤＮＡ疫苗，新型減毒活疫苗和佐劑疫苗，以改善疫苗開發(fā)和免疫原逡逑性（圖１．３）邋［１２Ｇ，１２１Ｌ水包油佐劑，例如ＭＦ５９和ＡＳ０３，改善對滅活流感疫苗的免逡逑疫反應(yīng)，特別是在幼兒（６個(gè)月及以上）和６０歲以上的人群中作用顯著。幾種此類逡逑季節(jié)性流感疫苗已在歐洲和北美洲的美國獲得許可。一般來說，水包油佐劑具有良逡逑好的免疫耐受性，其副作用類似于非佐劑滅活疫苗。然而，歐洲回顧性研宄的結(jié)果逡逑表明邋Ｐａｎｄｅｍｒｉｘ邋（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）和邋ＡＳ０３邋佐劑的邋ＨｌＮｌｐｄｍ０９邋疫苗，與隨后在邋２１逡逑歲以下接種疫苗的個(gè)體中發(fā)生嗜睡癥之間存在關(guān)聯(lián)。ＡＳ０３佐劑在這種關(guān)聯(lián)中的作逡逑用尚不清楚，其它因素包括特定的ＨＬＡ類型可能有一定的作用Ｐ２－１２４］。具有廣泛交逡逑叉保護(hù)活性的通用流感疫苗可以取代年度季節(jié)性流感疫苗接種，并對新出現(xiàn)的流感逡逑病毒提供保護(hù)。一種新型基于各種流感病毒靶標(biāo)的通用疫苗，如血凝素莖部蛋白，逡逑１３逡逑

學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文３１］。由于上述原因，迫切需要可以有效防止漂移變異的流感病毒疫苗，來應(yīng)對人畜共患流感病毒感染和新的大流行性流感病毒。應(yīng)答重新定向到病毒的保守位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。逡逑是普遍或廣泛保護(hù)的疫苗？通用流感病毒疫苗是覆蓋所有Ａ型苗，不依賴于抗原漂移或ＨＡ／神經(jīng)氨酸酶（ＮＡ）亞型。這將包１１種ＮＡ亞型的Ａ型流感病毒，Ｖｉｃｔｏｒｉａ和ａｎｃｅｓｔｒａｌ的Ｂ型流節(jié)性流感病毒毒株的未來漂移變異相比之下，廣泛保護(hù)疫苗被定義為涵蓋大部分流感病毒的疫苗，例如所有人類季節(jié)性１Ｎ１，Ｈ３Ｎ２和Ｂ型流感）。為了設(shè)計(jì)這些類型的疫苗，需要確定構(gòu)域／蛋白質(zhì)。這些疫苗的保護(hù)機(jī)制在很大程度上取決于所選擇的疫苗的接種方法和策略。通用流感病毒疫苗設(shè)計(jì)的幾個(gè)靶點(diǎn)，包，Ｍ２離子通道的胞外域（Ｍ２ｅ）和內(nèi)部蛋白質(zhì)核蛋白（ＮＰ）和（圖邋１．４）逡逑（ａ）邐（邐（ｂ）邐逡逑

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本文編號(hào)：2769082