【摘要】：戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)感染是世界性的公共衛(wèi)生問題,全球每年約2000萬人新發(fā)感染HEV。盡管臨床上戊型肝炎病程多呈急性自限性,但在部分特殊患者如器官移植、HIV、孕婦等人群中,極易發(fā)生肝衰竭或戊型肝炎慢性化。HEV感染慢性化、致肝硬化等患者及孕婦高病死率的機(jī)制尚不明確,亟待進(jìn)一步研究。巨噬細(xì)胞是天然免疫的重要組成部分,不僅可以吞噬并分泌多種炎性因子來消滅入侵的病原體,還可以起到抗原提呈作用連接天然免疫和特異性免疫應(yīng)答,協(xié)助清除被感染的細(xì)胞。同時,病毒感染會通過模式識別受體啟動先天抗病毒免疫反應(yīng),誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌干擾素來限制病毒復(fù)制及擴(kuò)散。但大部分病毒都已經(jīng)進(jìn)化出多種不同的策略來逃避宿主的免疫清除。目前研究證實(shí)戊型肝炎病毒開放讀碼框3蛋白(Open Reading Frame 3,ORF3)可以與宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用為HEV復(fù)制和疾病進(jìn)展創(chuàng)造良好的環(huán)境,在HEV感染和傳播過程中起著關(guān)鍵作用。因此,我們推測HEVORF3可能會影響巨噬細(xì)胞的免疫功能及其吞噬功能等,從而為HEV感染的慢性化,甚至繼發(fā)肝纖維化和肝硬化提供良好的免疫抑制環(huán)境。另外,HEVORF3還可能會影響模式識別受體來抑制宿主細(xì)胞內(nèi)的抗病毒免疫反應(yīng),幫助HEV逃逸免疫,維持持續(xù)復(fù)制狀態(tài)。目的:1.構(gòu)建HEV ORF3過表達(dá)載體,并建立不同感染模型的條件;2.明確HEVORF3對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控及對炎癥因子、趨化因子表達(dá)的影響;3.研究HEV ORF3對巨噬細(xì)胞吞噬功能、吞噬相關(guān)受體的影響;4.研究HEV ORF3對宿主細(xì)胞模式識別受體及其內(nèi)源性干擾素生成的調(diào)控作用,并進(jìn)一步探究其可能的作用機(jī)制。方法:1.分別構(gòu)建多種HEVORF3蛋白的過表達(dá)載體,包括慢病毒、腺病毒及質(zhì)粒載體,并進(jìn)行擴(kuò)增和提純;2.巨噬細(xì)胞模型采用佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)誘導(dǎo)人急性單核細(xì)胞白血病(THP1)細(xì)胞系分化為PMA-THP1巨噬細(xì)胞,過表達(dá)上述過表達(dá)載體并篩選合適的試驗(yàn)條件;根據(jù)人正常肝臟細(xì)胞L02細(xì)胞系、人肝癌細(xì)胞HepG2及Huh7細(xì)胞系中TLR7的表達(dá)水平,選擇合適的宿主細(xì)胞模型;3.PMA-THP1巨噬細(xì)胞中感染慢病毒或腺病毒載體后,給予細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后,利用ELISA、實(shí)時熒光定量PCR、Western blot等方法明確HEV ORF3對巨噬細(xì)胞炎癥及趨化因子表達(dá)的影響,并進(jìn)一步驗(yàn)證HEVORF3可以通過抑制NFκB信號通路來下調(diào)巨噬細(xì)胞炎癥及趨化因子的釋放;4.采用流氏細(xì)胞檢測及吞噬試驗(yàn)等方法明確HEV ORF3對巨噬細(xì)胞吞噬功能的抑制作用,并進(jìn)一步采用實(shí)時熒光定量PCR、Western blot等方法篩選出受調(diào)節(jié)的吞噬相關(guān)受體蛋白,結(jié)合激動劑及抑制劑的使用,探討可能的機(jī)制;5.分別在PMA-THP1巨噬細(xì)胞和L02細(xì)胞中過表達(dá)腺病毒及質(zhì)粒載體,研究HEV ORF3對宿主細(xì)胞內(nèi)源性干擾素的表達(dá)有調(diào)控作用。進(jìn)一步采取實(shí)時熒光定量PCR、Western blot等方法篩選顯著表達(dá)差異的模式識別受體,結(jié)合特異性信號通路調(diào)節(jié)劑,研究HEVORF3逃逸宿主細(xì)胞固有免疫作用的可能機(jī)制。結(jié)果:1.成功構(gòu)建基因1型HEV ORF3片段的慢病毒、腺病毒及質(zhì)粒載體,并進(jìn)行了擴(kuò)增和提純;2.10ng/mL PMA持續(xù)誘導(dǎo)THP1分化24h后,換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h即分化為成熟巨噬細(xì)胞;L02細(xì)胞系作為人正常肝臟細(xì)胞的永生化細(xì)胞系仍有具有正常肝細(xì)胞的特征,且其TLR7的表達(dá)水平明顯高于HepG2及Huh7細(xì)胞系,因此被本研究作為宿主細(xì)胞模型。3.ELISA及RT-qPCR結(jié)果提示HEV ORF3可以下調(diào)LPS誘導(dǎo)PMA-THP1巨噬細(xì)胞生成的炎癥因子和趨化因子的表達(dá)和分泌,且可能是通過下調(diào)TLR4并抑制NFκB信號通路活性發(fā)揮作用的;4.流式細(xì)胞檢測及吞噬試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HEV ORF3可以明顯抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能,RT-qPCR和western blot結(jié)果顯示吞噬相關(guān)受體CD14和CD64的表達(dá)有明顯降低,且CD14和CD64的下調(diào)可以通過JAK1/STAT1信號通路的特異性抑制劑ruxolinitib治療后逆轉(zhuǎn);5.ELISA及RT-qPCR結(jié)果提示HEV ORF3可以明顯抑制PMA-THP1及L02細(xì)胞中Ⅰ型內(nèi)源性干擾素的產(chǎn)生,而進(jìn)一步的RT-qPCR及western blot結(jié)果顯示TLR3和TLR7的表達(dá)有明顯下降,結(jié)合特異性激動劑和抑制劑研究發(fā)現(xiàn),HEVORF3過表達(dá)后可抑制多條信號通路包括p-P65、p-STAT1和p-JNK的活化水平,從而造成TLR7和干擾素的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論:1.HEV ORF3可以通過下調(diào)TLR4并抑制NFκB信號通路活性降低LPS誘導(dǎo)PMA-THP1巨噬細(xì)胞的炎癥和趨化因子的表達(dá)水平;2.HEV ORF3可以通過抑制JAK1/STAT1信號通路下調(diào)吞噬相關(guān)受體CD14和CD64的表達(dá),并抑制巨噬細(xì)胞的吞噬功能;3.HEV ORF3蛋白可以通過下調(diào)TLR3和TLR7,抑制Ⅰ型內(nèi)源性干擾素的產(chǎn)生。并且可以抑制多條信號通路包括NFκB,JAK/STAT和JNK/MAPK來下調(diào)TLR7蛋白的表達(dá);4.HEV ORF3蛋白可以通過上述多種作用途徑幫助HEV逃逸宿主免疫清除,為戊型肝炎慢性化的可能機(jī)制提供理論支持和補(bǔ)充。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

以ＧＡＰＤＨ作為內(nèi)參，計(jì)算出目的蛋白的相對表達(dá)量。逡逑．１０統(tǒng)計(jì)學(xué)分析逡逑使用ＳＰＳＳ１９．０對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Ｐ邋＜邋０．０５為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑組間比較采用ｔ檢驗(yàn)。計(jì)量資料以ＭＥＡＮ邋±邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｄｅｖｉａｔｉｏｎ表示，至少進(jìn)行３逡逑獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。逡逑結(jié)果逡逑．１邋ＰＣＲ擴(kuò)增ＯＲＦ３基因片段的電泳鑒定逡逑質(zhì)粒中ＯＲＦ３基因全長為４１５ｂｐ，ＰＣＲ法擴(kuò)增該片段，瓊脂糖凝膠電泳顯示在逡逑４１５ｂｐ處有明顯的目的條帶，電泳結(jié)果顯示條帶符合理論結(jié)果（圖１Ａ）。目的載體經(jīng)逡逑ｃｏＲ邋Ｉ－ＨＦ和ＢａｍＨ邋Ｉ－ＨＦ酶切后如圖１Ｂ所示，回收４７５８ｂｐ的載體片段。逡逑

２．４重組腺病毒感染２９３細(xì)胞及鑒定逡逑將重組腺病毒以ＭＯＩ邋２０感染ＰＭＡ－ＴＨＰ１細(xì)胞，４８ｈ時顯微鏡下觀察熒光表達(dá)逡逑效率約為９０％邋（圖４）。逡逑■■逡逑圖４．腺病毒感染ＰＭＡ－ＴＨＰ１細(xì)胞（ｘ２００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４．邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｒａｔｅ邋ｉｎ邋ＰＭＡ－ＴＨＰ１邋ｃｅｌｌｓ邋（３６邋ｈ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，邋ｘ２００）．逡逑３９逡逑

逡逑圖３Ａ．腺病k兇荊玻梗誠赴獗澩錚ǎ歟希希╁義希保埃峰澹保啊誨澹保埃矗卞澹保埃保板義稀觥觥觥鰣義賢跡常攏呦儼《鏡味炔舛ń峁ǎ歟希希╁義賢跡常儼《糾┰黽暗味炔舛�？哇E常粒合儼《駒冢玻梗誠赴械謀澩錛案腥拘剩煌跡常攏禾崠垮義蝦蟮南儼《鏡味炔舛ǎㄖ張ǘ任叮常

本文編號：2769012