【摘要】：細胞質(zhì)膜的內(nèi)、外側(cè)磷脂組成是不對稱的,磷脂酰絲氨酸幾乎只存在于質(zhì)膜內(nèi)側(cè)。剛好相反,細胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復合體和囊泡等細胞內(nèi)膜系統(tǒng)的磷脂酰絲氨酸幾乎只存在于膜外側(cè)。生長因子和激素等成分由于原分子具有信號肽,因此在完成合成和去掉信號肽后停留于細胞內(nèi)膜如囊泡等的囊腔中。外粒體(ectosomes)通常被認為是包含著一小部分質(zhì)膜和細胞質(zhì)從細胞質(zhì)膜芽生釋放出去的胞外囊泡。有些外粒體的膜外側(cè)含有較高的磷脂酰絲氨酸并且其囊腔中含有生長因子等成分,這些特征與細胞內(nèi)的囊泡相一致。為什么質(zhì)膜衍生物具有與胞內(nèi)囊泡相一致的組成與特征至今原因未明。我們利用原代培養(yǎng)膠質(zhì)細胞和細胞骨架解聚藥物,通過激光共聚焦的活細胞動態(tài)觀察等技術(shù)研究了外粒體的實時釋放過程。我們發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中至少有三種不同的外粒體釋放形式:第一種是經(jīng)典的質(zhì)膜芽生形式,其釋放過程較為緩慢,囊泡剛形成時較大,然后逐漸縮小至原來直徑的三分之一;第二種是囊泡在細胞表面的同一位點連續(xù)彈射出去,其釋放過程很快;第三種是大量的囊泡在一個細胞的整個表面幾乎同一時間由小到大釋放出去,囊泡表面積的總和估計比質(zhì)膜還要大。我們猜測后面兩種外粒體的形成似乎是細胞內(nèi)膜在細胞質(zhì)膜上由內(nèi)往外擠出去的。這類外粒體其外被有著與質(zhì)膜衍生的外粒體完全不同的膜內(nèi)外側(cè)磷脂組成,并且其腔內(nèi)含有與胞內(nèi)囊泡相同的生長因子等成分。我們的ER-tracker標記細胞實驗進一步表明,細胞內(nèi)膜確實能突破質(zhì)膜直接釋放至細胞外。因此,我們認為外粒體可分為兩大類:一類是由質(zhì)膜衍生而來,磷脂酰絲氨酸幾乎位于膜內(nèi)側(cè),包含物為細胞質(zhì);另一類由細胞內(nèi)膜衍生而來,磷脂酰絲氨酸幾乎位于膜外側(cè),包含物與內(nèi)膜囊腔成分一致,如生長因子等。本研究發(fā)現(xiàn)了外粒體釋放的新的途徑,合理地解釋了外粒體的外被特征和內(nèi)含物與從質(zhì)膜芽生不一致的原因。
【學位授予單位】：深圳大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2
【圖文】：

圖 1 在 20 μM 秋水仙素刺激下神經(jīng)膠質(zhì)細胞質(zhì)膜產(chǎn)生囊泡結(jié)構(gòu)原代神經(jīng)膠質(zhì)細胞在 4 孔 chamber 培養(yǎng)一周后，在共聚焦成像前使用活細胞 Ca2+染料 fluo-4（綠色）在37 ℃細胞培養(yǎng)箱避光進行染色 30 分鐘。Time series 程序設置成一秒掃描一幀圖像。在 Time series 程序開始掃描 30 秒后，等體積添加秋水仙堿溶液使其終濃度達到 20 μM。圖中的數(shù)字表示動態(tài)圖像中掃描的張數(shù)和秒數(shù)。箭頭顯示囊泡狀結(jié)構(gòu)在質(zhì)膜出芽，同時胞質(zhì)內(nèi)維持高濃度游離態(tài) Ca2+。3.1.2 在 30 μM 秋水仙堿溶液的處理下，觀察神經(jīng)膠質(zhì)細胞外粒體的釋放為了觀察細胞外粒體分泌時的釋放過程，我們增加了秋水仙堿的濃度。在活細胞成像前，培養(yǎng)在Chamber中的原代培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細胞用活細胞Ca2+染料Fluo-4，Ca2+染料 X-Rhod-1 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染料 ERtracker 避光染色 30 分鐘。在 Timeseries程序開始掃描至 30 秒時，在培養(yǎng)原代神經(jīng)膠質(zhì)細胞的 Chamber 中加入與培養(yǎng)基等體積的秋水仙堿溶液使其終濃度達到 30 μM。在秋水仙堿大約作用 30 秒時，

神經(jīng)膠質(zhì)細胞外粒體的釋放途徑及膜來源探究過程。首先在細胞邊緣形成大量具有很強 Ca2+信號的囊泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，這種結(jié)構(gòu)在開始時頂出形態(tài)較大，然后逐漸拉伸并且與質(zhì)膜的連接部分逐漸減小，囊泡結(jié)構(gòu)直徑也慢慢縮小為剛形成階段的三分之一（圖 3，箭頭所示），最后從質(zhì)膜夾斷脫落，完成釋放過程。外粒體產(chǎn)生過程中始終維持較強 Ca2+信號。外粒體體積縮小過程大約消耗 60 秒（圖 3，58s-120s），外粒體從質(zhì)膜脫落大約需要 80 秒（圖3，120 s-200 s），從外粒體的形成到最后的釋放過程大約總體耗時 3 分鐘左右。一般認為外界的一定刺激導致細胞胞質(zhì)內(nèi)流入大量游離的 Ca2+，觸發(fā)細胞骨架松動，從而引起外粒體釋放。我們的結(jié)果似乎表明秋水仙堿刺激引起微管解聚也會導致鈣內(nèi)流觸發(fā)外粒體的產(chǎn)生與釋放。我們認為 30μM 的秋水仙堿達到了刺激神經(jīng)膠質(zhì)細胞外粒體釋放所需的必要條件，耗時3分鐘完成了外粒體的形成和釋放。整個過程與其他細胞類型中描述的外粒體在質(zhì)膜形成出芽的過程相近。

外粒體從質(zhì)膜脫落大約需要 80 秒（圖3，120 s-200 s），從外粒體的形成到最后的釋放過程大約總體耗時 3 分鐘左右。一般認為外界的一定刺激導致細胞胞質(zhì)內(nèi)流入大量游離的 Ca2+，觸發(fā)細胞骨架松動，從而引起外粒體釋放。我們的結(jié)果似乎表明秋水仙堿刺激引起微管解聚也會導致鈣內(nèi)流觸發(fā)外粒體的產(chǎn)生與釋放。我們認為 30μM 的秋水仙堿達到了刺激神經(jīng)膠質(zhì)細胞外粒體釋放所需的必要條件，耗時3分鐘完成了外粒體的形成和釋放。整個過程與其他細胞類型中描述的外粒體在質(zhì)膜形成出芽的過程相近。圖 2 在 30 μM 秋水仙堿溶液的下神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生并釋放外粒體在活細胞成像前，chamber 中培養(yǎng)的原代神經(jīng)膠質(zhì)細胞用活細胞 Ca2+熒光染料 Fluo-4（綠色），Ca2+熒光染料X-Rhod-1（紅色）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng) ER tracker（藍色）在 37 ℃細胞培養(yǎng)箱避光染色 30 分鐘。Time series 程序設置40 μm

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本文編號：2766512