【摘要】：研究背景:減壓病(decompression sickness,DCS)是由于機(jī)體從高壓狀態(tài)向低壓梯度減壓,體內(nèi)溶解的氣體游離為氣相,以氣泡形式在血管和組織內(nèi)聚集,引起機(jī)體皮膚癢疹、循環(huán)呼吸功能異常、神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等一系列的癥狀。DCS是潛水職業(yè)中最常見的職業(yè)病,在以應(yīng)急為特點的潛艇脫險與水下救援等軍事潛水作業(yè)中尤為突出。因此,研究早期預(yù)防DCS的有效藥物和手段,不僅是潛水醫(yī)學(xué)研究的熱點問題,對我國軍事潛水人員作戰(zhàn)能力的保障和發(fā)展更是有著特殊意義。從循環(huán)系統(tǒng)的生理結(jié)構(gòu)和減壓過程體內(nèi)氣泡產(chǎn)生的規(guī)律可知,肺血管內(nèi)皮細(xì)胞是減壓氣泡損傷的首要靶點,這在既往實驗中得到證實�？梢酝茰y,通過血管內(nèi)皮保護(hù)能夠達(dá)到降低減壓過程對機(jī)體的損傷,從而獲得對DCS的預(yù)防作用。但已有的研究結(jié)果并未明確具體的損傷路徑和機(jī)制,同時針對內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)的單一靶點藥物研究未實現(xiàn)綜合防治減壓損傷的效果。我們認(rèn)為DCS的損傷機(jī)制十分復(fù)雜,單一靶點的藥理效果不足以緩解減壓應(yīng)激所導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷。我們預(yù)期中醫(yī)藥(traditional Chinese medicine,TCM)的多靶點作用可能能提供相對更系統(tǒng)有效的解決方案。通過前期預(yù)實驗的篩選,我們發(fā)現(xiàn),小檗堿(berberine,BBR)的藥理特性與減壓導(dǎo)致的內(nèi)皮損傷機(jī)制之間具有高度的對抗性。本研究關(guān)注:一是探討B(tài)BR預(yù)處理對DCS早期損傷的預(yù)防作用及劑量-效應(yīng)關(guān)系;二是分析減壓損傷對大鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響,探討B(tài)BR對DCS致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與凋亡的保護(hù)作用及可能機(jī)制;三是分析減壓損傷對大鼠肺血管分泌血管舒縮因子的影響,探討其在減壓損傷中的作用,以及BBR預(yù)處理通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)-一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)-一氧化氮(nitric oxide,NO)通路保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制。以期通過本實驗設(shè)計及其實施,能夠?qū)p壓病的早期預(yù)防提供有效的干預(yù)數(shù)據(jù)以及對相應(yīng)信號機(jī)制及作用靶點的效用提供實驗證據(jù)。研究技術(shù)方法:1.本研究以大鼠為研究對象,采用空氣介質(zhì)60msw壓力暴露60min后30s勻速減至常壓制備減壓損傷動物模型。預(yù)處理藥物給藥方法:對照組、模型組連續(xù)3天每日腹腔注射生理鹽水2ml。藥物使用組分為兩種使用時間,即三天藥物預(yù)處理和三小時藥物預(yù)處理。低劑量組、中劑量組、高劑量組,連續(xù)2天每日腹腔注射生理鹽水2ml,第3日高氣壓暴露前3h(10:00)腹腔分別以12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg腹腔注射BBR溶液;長時間藥物組連續(xù)3天以50mg/kg腹腔注射BBR溶液。減壓損傷和BBR預(yù)處理的干預(yù)效果評價指標(biāo)為預(yù)實驗經(jīng)過檢驗的指標(biāo)值:大體觀察發(fā)病時間、死亡時間和死亡率;肺組織病理、肺濕干比分析大鼠肺組織損傷狀況;全血自動分析儀檢測血細(xì)胞計數(shù)、血小板活性;ELISA測定肺損傷指標(biāo)外周血鎖鏈素(desmosine,DES)和肺組織IL-1β。2.在大鼠減壓損傷模型的基礎(chǔ)上,評估減壓損傷對大鼠肺血管內(nèi)皮凋亡的影響、NF-?B對肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用,BBR預(yù)處理的干預(yù)效果以及通過調(diào)節(jié)NF-?B表達(dá)調(diào)控肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制。采用ELISA檢測肺血管內(nèi)皮凋亡指標(biāo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、半胱天冬蛋白酶3(Caspase-3)、核因子?B(nuclear factorκB,NF-?B)。采用Real-Time PCR檢測肺血管細(xì)胞中的BAXmRNA、Bcl-2mRNA、Caspase-3mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。3.在大鼠減壓損傷模型的基礎(chǔ)上,評估MAPK-NOS-NO通路在減壓損傷致大鼠肺血管舒縮狀態(tài)改變的信號機(jī)制以及BBR預(yù)處理對該通路的調(diào)節(jié)作用。采用硝酸還原法檢測NO;采用免疫組化方法測定各組別肺組織eNOS、iNOS、nNOS分布,采用Western blot分析方法測定eNOS、iNOS、nNOS蛋白表達(dá),以及信號調(diào)控相關(guān)激酶ERK、JNK、p38的磷酸化水平。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS20.0進(jìn)行。計量數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)進(jìn)行描述;不同處理組采用?~2檢驗、獨(dú)立樣本t檢驗和ANOVA分析;指標(biāo)之間的相互關(guān)系采用皮爾遜相關(guān);指標(biāo)之間的依存關(guān)系采用回歸曲線擬合。p0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。研究結(jié)果:1.模型制備結(jié)果顯示,動物出艙后迅速出現(xiàn)DCS顯著特征,死亡率50%。與對照組比較,病理切片顯示明顯的肺組織水腫、充血,肺濕干比顯著升高(p0.05),血液DES顯著升高(p0.01),肺組織IL-1β含量顯著增高(p0.01);外周血WBC、RBC、NEUT顯著增加(p0.01),而PLT顯著下降(p0.01);TC、LDL-C顯著升高(p0.01)。2.BBR干預(yù)結(jié)果顯示,干預(yù)組死亡率有所下降,高劑量組與長時間用藥組40%,其余組30%。藥物干預(yù)組起病時間比模型組顯著推遲(?~2=12.30,p0.05)。病理切片顯示BBR對肺間質(zhì)白細(xì)胞浸潤和水腫有一定的減輕作用,對比各組干預(yù)結(jié)果,低劑量組減輕肺間質(zhì)水腫程度較高劑量組更明確,提示低劑量BBR的使用可能更有利于減輕極限減壓導(dǎo)致的肺損傷。與模型組相比,各干預(yù)組外周血WBC、RBC、NEUT顯著降低(p0.01 or p0.05),但仍高于對照組(p0.01 or p0.05);PLT顯著升高(p0.01),但仍低于對照組(p0.01)。肺濕干比低劑量、中劑量組與模型組無差異且均顯著高于對照組(p0.01),高劑量組與長時間用藥組與模型組、對照組相比均無顯著性差異。低劑量組、高劑量組DES與模型組相比顯著下降(p0.01),結(jié)果和對照組相比無顯著性差異;干預(yù)組肺組織IL-1β較模型組均顯著下降(p0.01)。匯總多項評價結(jié)果提示,不同劑量3h預(yù)處理的BBR對于降低機(jī)體減壓損傷均有著一定的效果,其中以低劑量組效果相對更優(yōu)。長時間用藥與3h用藥在效果上未體現(xiàn)出顯著差別。3.肺血管組織凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示,模型組Bcl-2蛋白表達(dá)比對照組顯著降低(p0.01),Bax顯著升高(p0.01),Bcl-2/Bax顯著下降(p0.01),Caspase-3顯著升高(p0.01)。低劑量BBR干預(yù)可使肺血管組織Bcl-2回升(p0.01)、Bax回落(p0.01)、Bcl-2/Bax顯著上升(p0.01)、Caspase-3顯著下降(p0.05)。中劑量和高劑量組與模型組比較能顯著提升Bcl-2蛋白表達(dá)(p0.05),但對Bax、Bcl-2/Bax、Caspase-3的作用無顯著性意義,三天用藥組與當(dāng)天用藥組相比顯著降低Bcl-2(p0.01)、提升Caspase-3(p0.01)。4.肺血管組織NF-?B結(jié)果顯示,減壓損傷顯著降低NF-?B的蛋白表達(dá)(p0.01)。低劑量和高劑量組BBR干預(yù)后,與模型組比較NF-?B有顯著回升(p0.05),與對照組無顯著區(qū)別。長時間用藥組與對照組相比NF-?B顯著下降(p0.01),與模型組無顯著性差異。Bcl-2/Bax和Caspase-3的變化與NF-?B有顯著的線性關(guān)系(R~2_(Bcl-2/Bax)=0.556,F=43.742,p0.01;R~2_(Caspase-3)=0.486,F=33.148,p0.01)。5.肺血管組織中凋亡相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果顯示,減壓損傷后Bax mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)(P0.05),而Bcl-2、Caspase-3mRNA無顯著差異。BBR干預(yù)結(jié)果顯示,低劑量組較模型組Bax mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)(p0.01),但其他干預(yù)組與模型組無顯著差異。Bax mRNA隨著劑量的增加,轉(zhuǎn)錄活性有增加趨勢。長時間藥物組和高劑量組無顯著差異。6.外周血血管活性因子結(jié)果顯示,模型組NO顯著降低(p0.01)。BBR干預(yù)后,NO有回升的趨勢,低劑量組、中劑量組、長時間用藥組NO顯著升高(p0.05);長時間用藥組NO顯著高于高劑量組(p0.01)。外周血NO含量與用藥劑量呈正相關(guān)(r=0.773,p0.01)。7.肺組織NOS定量檢測的結(jié)果顯示,模型組肺組織NOS蛋白含量顯著下降(p0.05);免疫組化觀察發(fā)現(xiàn),eNOS主要分布在血管內(nèi)皮和肺泡上皮,并且存在基礎(chǔ)性表達(dá),模型組eNOS表達(dá)降低;三種亞型WB結(jié)果顯示,模型組三種亞型均有下降趨勢,但差異未達(dá)到顯著性水平。BBR干預(yù)后,與模型組相比,中劑量組、長時間用藥組NOS顯著升高(p0.01 or p0.05),各干預(yù)組肺組織NOS蛋白含量均與對照組無顯著差異。三種亞型免疫組化結(jié)果顯示,BBR干預(yù)組血管內(nèi)皮和肺泡上皮的eNOS分布明顯增加;三種亞型WB結(jié)果顯示,長時間用藥組eNOS蛋白表達(dá)均較模型組顯著增加(p0.01),且顯著高于對照組(p0.05)。iNOS的變化與eNOS類似,但未達(dá)到顯著性水平。肺組織NOS的表達(dá)對外周血NO的回歸曲線具有較好的預(yù)測性(R~2=0.325,F=16.881,p0.01),并且與用藥劑量呈相關(guān)(r=0.730,p0.01)。8.肺組織MAPK磷酸化水平結(jié)果顯示,模型組JNK、p38的磷酸化水平顯著降低(p0.01),ERK的磷酸化水平無顯著差異。BBR干預(yù)組p-JNK水平均顯著高于模型組(p0.01),且與劑量存在相關(guān)性(r=0.865,p0.01)。長時間用藥組p-JNK顯著高于高劑量組(p0.01)。BBR干預(yù)后p-p38的變化與p-JNK類似存在顯著差異變化(與模型組相比p0.05)。肺組織p-JNK、p-p38與NOS存在顯著預(yù)測性(R~2_(JNK)=0.609,F=29.550,p0.01;R~2_(p38)=0.552,F=23.395,p0.01),并且與用藥劑量呈正相關(guān)(r_(JNK)=0.865,p0.01;r_(p38)=0.856,p0.01)。研究結(jié)果提示:病理、肺濕干重比、DES、IL-1β結(jié)果提示減壓損傷通過血管內(nèi)氣泡在肺的累積,導(dǎo)致肺組織水腫、充血、組織結(jié)構(gòu)破壞和炎癥反應(yīng)。肺血管組織凋亡相關(guān)指標(biāo)結(jié)果提示,減壓損傷可導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和功能損傷,甚至誘導(dǎo)凋亡。外周血NO結(jié)果提示減壓損傷可引起血管舒縮功能的變化。NO異常與肺組織NOS含量相關(guān),NOS蛋白表達(dá)與MAPK磷酸化水平存在線性關(guān)系,提示MAPK-NOS-NO途徑在肺組織的減壓損傷中發(fā)揮作用。研究結(jié)果證實了肺血管內(nèi)皮是減壓損傷的重要靶器官,血管內(nèi)減壓性氣泡通過損傷肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致血管舒縮因子合成和分泌異常,誘發(fā)一系列繼發(fā)反應(yīng)。各項結(jié)果均提示BBR能有效降低減壓損傷。BBR的效應(yīng)主要體現(xiàn)在:(1)上調(diào)MAPK的JNK、p38不包括ERK的磷酸化水平,進(jìn)而上調(diào)eNOS轉(zhuǎn)錄水平,增加eNOS在肺血管內(nèi)皮的蛋白表達(dá),提高NO的合成和分泌,后者可通過舒張血管和抑制血小板集聚、白細(xì)胞活化等損傷性炎癥反應(yīng)到達(dá)降低減壓損傷的最終目標(biāo);(2)增加減壓后肺組織血管組織的NF-?B的蛋白表達(dá),進(jìn)而下調(diào)其凋亡相關(guān)基因Bax的基因表達(dá),抑制血管內(nèi)氣泡誘導(dǎo)的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,從而保護(hù)血管內(nèi)皮功能,達(dá)到對抗減壓損傷的作用。BBR的作用對MAPK-NOS-NO存在一定的劑量依賴性,劑量越大JNK、p38的磷酸化水平越高,NOS表達(dá)越高,NO合成增加。從大鼠的損傷指標(biāo)來看,適度增加的NO濃度有利于肺血管維持合理的舒縮功能,但大劑量BBR一方面可能導(dǎo)致血管的過度擴(kuò)張,另一方面對肺血管內(nèi)皮細(xì)胞從抑凋亡轉(zhuǎn)向促凋亡作用,大體觀察和減壓損傷的其他指標(biāo)也提示,雖然高劑量BBR的綜合預(yù)防效果能起到一定作用,但整體遜于中低劑量,因此,要使BBR能夠產(chǎn)生更優(yōu)抗減壓損傷作用,真正實現(xiàn)其預(yù)防意義,應(yīng)在不同減壓應(yīng)激、不同作用環(huán)境等條件下作進(jìn)一步探索研究,以在多種靶點作用之間尋求平衡。本課題研究結(jié)果不僅進(jìn)一步豐富了對減壓病機(jī)體損傷機(jī)制的認(rèn)識,而且初步探索了中藥成分BBR在減壓損傷預(yù)防中的價值,更重要的是發(fā)現(xiàn)了BBR減壓暴露前單次用藥或可達(dá)到多途徑對抗減壓損傷的效果,既為進(jìn)一步發(fā)掘適應(yīng)遠(yuǎn)海救生需求的快速藥物干預(yù)措施提供了基礎(chǔ)實驗依據(jù),又為軍事健康和安全領(lǐng)域中醫(yī)藥手段的應(yīng)用打開了新的研究思路。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R845.21;R-332
【圖文】：

242加雙蒸水后定容至 1000 ml4.0.01M PBS (pH=7.4)KH2PO40.27gNa2HPO41.14gNa2HPO4·7H2O 2.15 gNaH2PO4·2H2O 2.88gNaCl 8.00gKCl 0.20g加純化水定容至 1000ml（六）高氣壓暴露方案高氣壓暴露使用海軍醫(yī)科大學(xué)特色醫(yī)學(xué)中心水下醫(yī)學(xué)實驗室 112 動物快速上浮模擬艙。

圖 2 不同組別大鼠 DCS 起病時間和存活時間的生存分析A:不同組別大鼠 DCS 起病時間的生存分析;B:不同組別大鼠存活時間的生存分析.Figue 2 Comparison of the time of DCS onset and survial between different group’s animals.A:Comparison of the time of DCS onset between different group’s animals；B:Comparison ofthe time of survial between different group’s animals.表 2 不同組別大鼠 DCS 發(fā)病率和死亡率比較Table 2 Comparison of DCS icidence and motality of different group’s animals組別 例數(shù)DCS 發(fā)病 DCS 死亡例數(shù) % 例數(shù) %control 10 0 0 0 0model 10 10 100a5 50.00am+BBR12.5+3h 10 9 90.00a3 30.00m+BBR25+3h 10 10 100.00a3 30.00m+BBR50+3h 10 10 100.00a4 40.00am+BBR50+3d 10 9 90.00a4 40.00a備注：“a”表示與對空白組相比 p < 0.05.

圖 3 不同組別大鼠肺濕干比比較空白組相比 p < 0.05.f lung tissue wet-dry ratio between different group’s an較發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組、低劑量7，p低劑量組=0.001，p中劑量組=0.007）；與模型組相；3h 預(yù)處理組之間（低劑量組、中劑量組、高藥時間長短（高劑量組 vs 長時間用藥組）對病理改變病理切片的蘇木精伊紅（hematoxylin eosin，H動物，明顯肺間質(zhì)水腫和白細(xì)胞浸潤；同時可內(nèi)凝血。BBR 預(yù)處理明顯減輕了減壓負(fù)荷導(dǎo)致

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本文編號：2767495