發(fā)布時(shí)間：2020-07-22 15:15

【摘要】：人成熟精子進(jìn)入女性生殖道后,需要經(jīng)歷一系列生理生化過程,包括獲能、超活化運(yùn)動(dòng)、趨化運(yùn)動(dòng)和頂體反應(yīng)等,最終才能和卵細(xì)胞結(jié)合形成受精卵。其中,雌性生殖道內(nèi)的生理因子是調(diào)節(jié)上述生理生化過程的重要因素。有研究表明,胞外ATP(ATPe)對(duì)人成熟精子的運(yùn)動(dòng)、超活化運(yùn)動(dòng)和頂體反應(yīng)均有顯著影響。ADP是一種ATP的天然代謝物,胞外ADP(ADPe)是否影響人精子的生理功能以及相關(guān)的機(jī)制目前都尚未探究。鈣離子在精子功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的第二信使。利用多功能酶標(biāo)儀檢測胞內(nèi)Ca~(2+)濃度([Ca~(2+)]_i),本課題首先考察了ADPe對(duì)人精子[Ca~(2+)]_i的影響。結(jié)果表明,ADPe(50,100,200,500,1000,2500μM)濃度依賴性的增加人精子[Ca~(2+)]_i,并在1000μM處達(dá)到飽和。利用Ca~(2+)螯合劑BAPTA使精子處在無鈣環(huán)境中,ADPe不能引起[Ca~(2+)]_i增加,表明ADPe引起的[Ca~(2+)]_i增加是由外Ca~(2+)內(nèi)流導(dǎo)致。由于P2Y受體是與ADPe結(jié)合的膜受體,本課題通過western-blot檢測發(fā)現(xiàn)人成熟精子中P2Y(1,2,13,14)受體表達(dá),而廣譜型P2Y受體抑制劑suramin和PPADs顯著抑制ADPe誘導(dǎo)的精子[Ca~(2+)]_i增加。進(jìn)一步考察P2Y(1,2,13,14)抗體對(duì)ADPe所誘導(dǎo)的人精子[Ca~(2+)]_i增加的影響,結(jié)果顯示只有P2Y13抗體體現(xiàn)出顯著的抑制作用,提示P2Y13受體介導(dǎo)了ADPe導(dǎo)致的人精子[Ca~(2+)]_i增加。P2Y13受體作為一種G蛋白偶聯(lián)受體,并不能直接介導(dǎo)Ca~(2+)內(nèi)流�；贑atSper是目前已知的唯一公認(rèn)的精子特異性鈣離子通道,本課題進(jìn)一步研究ADPe所導(dǎo)致的人精子[Ca~(2+)]_i增加是否由CatSper介導(dǎo)。膜片鉗檢測結(jié)果表明,ADPe顯著的增加CatSper電流,而P2Y受體的抑制劑PPADs和suramin、以及P2Y13抗體均能顯著的抑制ADPe導(dǎo)致的CatSper電流增加。此結(jié)果表明:ADPe與P2Y13結(jié)合后通過激活CatSper通道而導(dǎo)致了人精子[Ca~(2+)]_i升高。然而,其中P2Y13活化后如何激活CatSper的信號(hào)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。本課題還考察了ADPe對(duì)人成熟精子功能的影響,發(fā)現(xiàn)上述濃度的ADPe能促進(jìn)人成熟精子的超活化運(yùn)動(dòng),表明ADPe導(dǎo)致[Ca~(2+)]_i增加具有顯著的生理效應(yīng),也與CatSper是調(diào)控精子超活化運(yùn)動(dòng)的主要分子的觀點(diǎn)一致。綜上所述,ADPe通過激活人成熟精子細(xì)胞膜表面的P2Y13受體,繼而激活CatSper通道,使[Ca~(2+)]_i顯著增加。與此同時(shí),ADPe促進(jìn)人成熟精子超活化。本課題對(duì)深入認(rèn)識(shí)生理?xiàng)l件下胞外ATP/ADP在受精過程中的作用與機(jī)制具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R321.1
【圖文】：

哺乳動(dòng)物成熟精子具有一個(gè)高度濃縮的細(xì)胞核，因此不具備轉(zhuǎn)錄和翻譯功能[2]。因此成熟精子的生理功能完全依賴于轉(zhuǎn)錄翻譯后蛋白修飾�；� Ca2+信號(hào)在蛋白翻譯后的核心調(diào)控作用，因此其對(duì)成熟精子功能調(diào)節(jié)尤為重要。大量研究已表明 Ca2+幾乎參與精子受精整個(gè)生理過程中。如精子獲能，超活化運(yùn)動(dòng)，趨化反應(yīng)，頂體反應(yīng)等生理過程。雌性生殖道內(nèi)的生理因子，如孕酮、睪酮、cAMP、白蛋白等[16, 18-22]，也主要通過調(diào)節(jié)[Ca2+]i濃度來快速調(diào)節(jié)精子的生理功能。成熟精子[Ca2+]i主要來源于細(xì)胞膜上離子通道介導(dǎo)的外鈣內(nèi)流[23]。目前精子上發(fā)現(xiàn)的幾種主要介導(dǎo)胞外 Ca2+內(nèi)流的通道包括經(jīng)典的電壓門控鈣離子通道（Ca2+v） TRP 通道，CNG 通道和精子特異性的 CatSper 通道（CatSper 通道也具有電壓依賴性）。已有研究表明小鼠[Ca2+]i調(diào)控主要依賴于 Cav2,TRPC2 和CNGA3 通道。隨著研究不斷深入，大量數(shù)據(jù)表明 CatSper 通道對(duì)精子[Ca2+]i調(diào)控扮演著密不可分的角色。CatSper1-4 缺失的小鼠是不育的[24-27]。臨床數(shù)據(jù)也表明 CatSper1，2 缺失的男性存在不育的情況[28-29]。

]i又逐漸恢復(fù)至靜息水平附近（圖3.1A）。100 μM ADP 顯著的引起[Ca2+]i 增加，且 1000 μM ADP 引起精子[Ca2+]i 增加達(dá)到最大值。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析顯示 ADPe 增加[Ca2+]i 的最高幅度為 45.9%（圖 3.1 B）。通過制作濃度依賴曲線，發(fā)現(xiàn) ADPe 誘導(dǎo)人精子[Ca2+]i 的半最大激活濃度為為562 μM (EC50=562 μM)（圖 3.1 C）圖 3.1ADP 濃度依賴性的增加人精子[Ca2+]iFig 3.1 ADPe dose-dependently increases human sperm [Ca2+]i

濃度增加幅度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，n=5；（C）ADPe 誘導(dǎo)[Ca2+]i的濃度依賴曲線，EC50=562 μM(A) The time-course curves showed the changes of human sperm [Ca2+]iinduced by AD(50-2500 μM); (B) Statistical analysis the amplitude changes of [Ca2+]ievoked by ADPe, n=5; Dose-response curve of ADPe induced [Ca2+]i, EC50=562 μM.3.1.2 ADPe 增加的[Ca2+]i來源于胞外 Ca2+內(nèi)流人精子胞內(nèi) Ca2+主要來源于胞內(nèi)高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的 Ca2+庫釋放和胞Ca2+內(nèi)流。為進(jìn)一步分析 ADPe 誘導(dǎo)的人精子[Ca2+]i來源，我們利用 Ca2+螯合BAPTA 使精子處于無 Ca2+環(huán)境中，來觀察 ADP 對(duì)[Ca2+]i濃度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)表明當(dāng)精子懸液與含有 12 mM BAPTA 溶液按照 1：1 比例混合，精子[Ca2+]i于靜息水平。該效應(yīng)可能是由于 BAPTA 螯合精子胞外溶液中的 Ca2+使精子胞Ca2+濃度處于極低的水平，精子為適應(yīng)胞外環(huán)境的變化，而使得胞內(nèi) Ca2+排出致。當(dāng)精子懸液與 12 mM BAPTA 和 2000 μM ADPe 的無外鈣溶液 1：1 混合結(jié)果顯示 ADPe 不能增加[Ca2+]i（圖 3.2）。結(jié)果表明 ADPe 誘導(dǎo)的人精子[Ca2來源于是外 Ca2+內(nèi)流。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王莎麗;精子的趨溫性及其意義[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2004年01期

本文編號(hào)：2765995