【摘要】：腸道病毒EV71(Enterovirus 71,EV71)作為引發(fā)手足口病(Hand Foot Mouth Disease,HFMD)的主要病原體,可導致腦炎、腦膜炎、急性弛緩性麻痹、心肺功能衰竭甚至死亡。然而,目前對腸道病毒EV71感染機制仍不夠清晰,國家和社會對相關(guān)疾病的防控依然面臨巨大挑戰(zhàn)。示蹤病毒感染途徑是研究病毒感染機制不可或缺的手段,而病毒的成功標記是實現(xiàn)病毒示蹤的關(guān)鍵。常規(guī)的基因工程、直接化學偶聯(lián)或病毒自組裝等方法存在操作繁雜,標記效率低,普適性差和影響病毒活性等缺陷,難以推廣應(yīng)用。近年來,基于代謝工程的生物正交標記技術(shù)由于具有高效、特異、無損、穩(wěn)定的優(yōu)勢,正日益成為標記活體生物系統(tǒng)的重要手段。該策略通過天然代謝途徑在靶標物中引入特定的化學報告基團,然后通過生物正交反應(yīng)與攜帶配對基團的標記物進行共價連接,從而實現(xiàn)對靶標物的特異標記。鑒于病毒衣殼蛋白合成依賴于宿主細胞,因此利用細胞氨基酸代謝可有效實現(xiàn)病毒衣殼修飾。為實現(xiàn)腸道病毒EV71高效無損的標記與示蹤,本研究提出一種新型的基于氨基酸代謝的病毒原位生物正交標記技術(shù),并利用該技術(shù)對腸道病毒EV71侵染機制進行深入探究。1.基于氨基酸代謝修飾的腸道病毒EV71生物正交標記技術(shù)的建立。利用宿主細胞氨基酸代謝將甲硫氨酸疊氮衍生物(L-Azidohomoalanine,Aha)嵌入子代病毒衣殼蛋白中,成功制備疊氮修飾的腸道病毒EV71(N3-EV71)。N3-EV71通過生物正交反應(yīng)與攜帶二苯基環(huán)辛炔(DBCO)的熒光探針形成穩(wěn)定連接,從而成功實現(xiàn)病毒的原位標記。結(jié)果表明,DBCO-探針能夠高效、特異地捕獲N3-EV71病毒粒子實現(xiàn)病毒標記,并且疊氮基團的代謝修飾和熒光探針的原位標記能有效保護病毒侵染活性,為后續(xù)病毒的動態(tài)示蹤提供了可靠的技術(shù)手段。2.生物正交標記動態(tài)示蹤研究腸道病毒EV71的侵染機制。我們運用SYTO染料與原位生物正交技術(shù)分別對病毒核酸與衣殼進行無損標記,實現(xiàn)病毒雙重標記與動態(tài)示蹤。結(jié)果顯示,腸道病毒EV71與細胞表面清道夫受體結(jié)合后經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞入胞,并在晚期內(nèi)涵體酸性環(huán)境中完成病毒核酸的快速釋放,闡明了EV71病毒的侵染過程與脫衣殼機制。本研究提出并建立了一種新型的基于氨基酸代謝的原位生物正交標記技術(shù),并利用該技術(shù)對腸道病毒EV71進行無損標記與動態(tài)示蹤,成功闡明其侵染機制,為相關(guān)抗病毒藥物的研制提供新的理論依據(jù)。
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院深圳先進技術(shù)研究院)
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R373.25
【圖文】：

第 1 章 引言足口病和腸道病毒 EV71足口病（HandFootMouthDisease,HFMD）于 1957 年首次在新西蘭發(fā)現(xiàn)亞太地區(qū)流行[1,2]（如圖 1.1）[3]。HFMD 是一種常見于 5 歲以下幼兒的，通常被感染患者表現(xiàn)出惡心、嘔吐、低熱、厭食和手、足、口等部位或潰瘍等臨床癥狀[4]。HFMD 由腸道病毒感染引起，其中柯薩奇病毒 Asackievirus A16，CA16）和腸道病毒 EV71（Enterovirus 71, EV71）是主病原體，而且由腸道病毒 EV71 感染引起的 HFMD 可能發(fā)展為腦炎、急性弛緩性麻痹和心肺功能衰竭甚至死亡[5]。由于目前對腸道病毒 EV制缺乏深入研究，國家和社會對相關(guān)疾病的防控依然面臨巨大挑戰(zhàn)。

圖 1.2 腸道病毒 EV71 結(jié)構(gòu)與基因組示蹤的研究進展宿主細胞是一個連續(xù)動態(tài)的復雜過程，主要包括：識裝和子代病毒釋放等過程。而常規(guī)的對病毒侵染機制連續(xù)觀察。近年來，隨著光學成像技術(shù)的發(fā)展，病毒病毒感染機制的有效方法[9]，病毒感染機制的研究對染疾病具有重大意義。目前可用于病毒標記示蹤的方直接化學偶聯(lián)或物理嵌合法，以及病毒自組裝法。程標記技術(shù)標記法不僅應(yīng)用于病毒粒子的標記，還常見于動植物記[10]。病毒基因工程標記法指將報告基因（熒光蛋白

在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察 HSV-1 組織趨作用。程標記技術(shù)在理論上被認為是最高效的病毒標記方法不僅技術(shù)要求高而且操作過程繁雜甚至會導于很大一部分熒光蛋白的錯誤折疊、發(fā)色團不成熟的熒光強度下降，這種情況在小尺寸病毒粒子中，體積較大的熒光蛋白（~27 kDa）往往會降低免上述蛋白基因融合所帶來的問題，部分研究者半胱氨酸短肽標簽（TC-tag）修飾蛋白而后利用分研究者使用 20kDa 的 SNAP-tag 標簽（人的氧型體），其可通過與芐基鳥嘌呤衍生物共價連接技術(shù)發(fā)展不成熟，尚未普遍用于病毒示蹤標記研標記[20]。

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王成宇;;感染腸道病毒71型的手足口病患兒相關(guān)免疫狀態(tài)變化[J];中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用;2016年23期

2 張惠芬;袁惠;;腸道病毒71與小兒急性呼吸道感染相關(guān)性研究[J];山西醫(yī)藥雜志;2017年09期

3 黃先萍;余中紅;劉可心;;2015-2016年德陽市兒童腸道病毒71型感染手足口病的流行病學特點及防治分析[J];中國婦幼保健;2017年13期

4 錢慧莉;王秀霞;閻志新;張有起;謝菲;;腸道病毒71型危重癥手足口病多臟器損害的機制[J];臨床薈萃;2017年10期

5 張小康;咼生容;馬曉良;張大軍;;抗腸道病毒靶點藥物研究進展[J];中國醫(yī)藥生物技術(shù);2016年05期

6 郭靖;;重癥腸道病毒71型感染手足口病研究進展[J];中國藥業(yè);2015年05期

7 楊平;;寶寶得了手足口病,別慌[J];幼兒教育;2016年29期

8 梁輝;許燕;;手足口病可以預防嗎[J];健康博覽;2017年03期

9 彭紅飛;王停波;向方槐;李彩華;何錦屏;龔萍;;腸道病毒71型6例檢測報告及文獻復習[J];內(nèi)蒙古中醫(yī)藥;2014年12期

10 朱琥;韓曉群;;2012年武漢地區(qū)手足口病腸道病毒分型與臨床特征分析[J];武漢大學學報(醫(yī)學版);2014年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉亞靜;張群;朱利塞;魯海冰;胡俊英;李欣;何佳;王新平;;E種腸道病毒與羊腸道病毒間的抗原交叉性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第九次全國會員代表大會暨第十七次全國學術(shù)研討會論文集[C];2017年

2 徐勇勝;;腸道病毒71型感染所致肺水腫的預測及干預的研究[A];中華醫(yī)學會第十七次全國兒科學術(shù)大會論文匯編（下冊）[C];2012年

3 徐勇勝;;腸道病毒71型感染所致肺水腫的預測及干預的研究[A];中華醫(yī)學會第十三屆全國兒科呼吸學術(shù)會議論文匯編[C];2012年

4 陳友鵬;梁旭競;;腸道病毒71型感染所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害及其免疫發(fā)病機制[A];第四屆中國醫(yī)師協(xié)會感染科醫(yī)師大會暨傳染病診治高峰論壇、浙江省醫(yī)學會肝病、感染病學學術(shù)年會論文匯編[C];2011年

5 羅文英;趙衛(wèi);曹虹;劉建軍;張仁利;;腸道病毒71型感染人腦微血管內(nèi)皮細胞的比較蛋白質(zhì)組學研究[A];新發(fā)傳染病研究熱點研討會論文集[C];2012年

6 張欣;鄧小玲;管大偉;鄭煥英;郭雪;楊杏芬;柯昌文;;2008年廣東省腸道病毒71型分離株全基因組核苷酸序列分析[A];新發(fā)和再發(fā)傳染病防治熱點研討會論文集[C];2009年

7 吳亦棟;周俊;陳東;趙仕勇;韋翊;;腸道病毒核酸與抗體聯(lián)合檢測在手足口病病原早期診斷中的應(yīng)用[A];2015浙江省檢驗醫(yī)學學術(shù)年會論文匯編[C];2015年

8 袁藝;宋國維;曹玲;崔小岱;錢淵;朱春梅;伏謹;馬連華;許崢;朱汝南;鄧潔;王芳;趙林清;;腸道病毒相關(guān)的小兒急性呼吸道感染的研究[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

9 王彥霞;康鍇;黃學勇;陳豪敏;許汴利;;河南省2011年健康人群腸道病毒帶毒率監(jiān)測[A];中華醫(yī)學會全國新發(fā)和再發(fā)傳染病2012年學術(shù)研討會論文匯編[C];2012年

10 錢澄懷;熊華;;嬰幼兒糞便標本中晶格樣結(jié)構(gòu)物與腸道病毒的關(guān)系[A];第五次全國電子顯微學會議論文摘要集[C];1988年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 方舟子;手足口病有那么可怕嗎？[N];中國青年報;2011年

2 本報見習記者 卜葉;夏季來臨 小心B族腸道病毒[N];中國科學報;2019年

3 北京地壇醫(yī)院主任醫(yī)師 蔡fg東;柯薩奇A6病毒來襲 怎么防[N];健康報;2016年

4 本報記者 燕聲;別輕視你遇到的小腹瀉[N];保健時報;2017年

5 本報記者 董超;夏天到了，手足口病“蠢蠢欲動”[N];保健時報;2017年

6 胡德榮;中美科研合作結(jié)碩果：ECHO30腸道病毒基因測序完成[N];中國醫(yī)藥報;2005年

7 林湘艷;春天,警惕孩子患上手足口病[N];中國中醫(yī)藥報;2009年

8 朱本浩;小兒腸道病毒疾病知多少[N];科技日報;2005年

9 周立民邋熊潤頻;阜陽腸道病毒EV71感染者升至915例[N];新華每日電訊;2008年

10 周立民;阜陽789名兒童感染腸道病毒,死亡19人[N];新華每日電訊;2008年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 韓陽;SIRT1干擾腸道病毒71型復制的機理[D];武漢大學;2017年

2 張暢;小鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育對腸道病毒71型易感性影響研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2018年

3 羅震;聚胞嘧啶結(jié)合蛋白1調(diào)控腸道病毒71型基因表達和復制的分子機制研究[D];武漢大學;2014年

4 楊小丹;腸道病毒71型抑制經(jīng)典應(yīng)激顆粒形成的機理研究[D];武漢大學;2018年

5 周世力;腸道病毒71型基因組研究和SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的鑒定與分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學;2004年

6 潘文勝;新型病原體的探索研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;1999年

7 張文清;RT-PCR對水中腸道病毒滅活效果及機制的評價研究[D];第四軍醫(yī)大學;1996年

8 王曉美;長春地區(qū)手足口病的臨床特征和腸道病毒71型的分子生物學特點[D];吉林大學;2012年

9 茅凌翔;腸道病毒71型分子流行病學調(diào)查及miRNA抑制腸道病毒71型體外復制的研究[D];江蘇大學;2011年

10 高璐璐;手足口病的監(jiān)測及腸道病毒71型病原學特性和致病性研究[D];南方醫(yī)科大學;2010年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 周婷;以腸道病毒71型3C~(pro)及柯薩奇B3型3D~(pol)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的藥物開發(fā)[D];廈門大學;2017年

2 周慧婷;腸道病毒EV71的腸道感染途徑和免疫激活特性初探[D];武漢大學;2018年

3 李玉靜;以結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的腸道病毒71型2A蛋白酶抑制劑設(shè)計[D];廈門大學;2017年

4 王芳芳;基于氨基酸代謝的原位生物正交標記動態(tài)示蹤腸道病毒EV71侵染的研究[D];中國科學院大學(中國科學院深圳先進技術(shù)研究院);2019年

5 林佩欣;腸道病毒71型致病機理初步研究[D];南方醫(yī)科大學;2015年

6 張群;羊腸道病毒小鼠感染模型的建立及病毒組織嗜性的研究[D];吉林大學;2018年

7 李純;腸道病毒71型2A蛋白關(guān)鍵氨基酸突變對病毒毒力的影響[D];山東大學;2018年

8 肖慧敏;腸道病毒71型通過抑制TRIM25的表達影響RIG-I信號傳導[D];吉林大學;2018年

9 尹丹;腸道病毒71型RT-RPA檢測方法的建立與評價[D];南方醫(yī)科大學;2018年

10 陳經(jīng)綸;腸道病毒71型感染人Jurkat細胞模型的建立及其對γ-干擾素分泌的影響[D];廣西醫(yī)科大學;2018年

本文編號：2764623