【摘要】：腸道病毒EV71(Enterovirus 71,EV71)作為引發(fā)手足口病(Hand Foot Mouth Disease,HFMD)的主要病原體,可導(dǎo)致腦炎、腦膜炎、急性弛緩性麻痹、心肺功能衰竭甚至死亡。然而,目前對(duì)腸道病毒EV71感染機(jī)制仍不夠清晰,國家和社會(huì)對(duì)相關(guān)疾病的防控依然面臨巨大挑戰(zhàn)。示蹤病毒感染途徑是研究病毒感染機(jī)制不可或缺的手段,而病毒的成功標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)病毒示蹤的關(guān)鍵。常規(guī)的基因工程、直接化學(xué)偶聯(lián)或病毒自組裝等方法存在操作繁雜,標(biāo)記效率低,普適性差和影響病毒活性等缺陷,難以推廣應(yīng)用。近年來,基于代謝工程的生物正交標(biāo)記技術(shù)由于具有高效、特異、無損、穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì),正日益成為標(biāo)記活體生物系統(tǒng)的重要手段。該策略通過天然代謝途徑在靶標(biāo)物中引入特定的化學(xué)報(bào)告基團(tuán),然后通過生物正交反應(yīng)與攜帶配對(duì)基團(tuán)的標(biāo)記物進(jìn)行共價(jià)連接,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)物的特異標(biāo)記。鑒于病毒衣殼蛋白合成依賴于宿主細(xì)胞,因此利用細(xì)胞氨基酸代謝可有效實(shí)現(xiàn)病毒衣殼修飾。為實(shí)現(xiàn)腸道病毒EV71高效無損的標(biāo)記與示蹤,本研究提出一種新型的基于氨基酸代謝的病毒原位生物正交標(biāo)記技術(shù),并利用該技術(shù)對(duì)腸道病毒EV71侵染機(jī)制進(jìn)行深入探究。1.基于氨基酸代謝修飾的腸道病毒EV71生物正交標(biāo)記技術(shù)的建立。利用宿主細(xì)胞氨基酸代謝將甲硫氨酸疊氮衍生物(L-Azidohomoalanine,Aha)嵌入子代病毒衣殼蛋白中,成功制備疊氮修飾的腸道病毒EV71(N3-EV71)。N3-EV71通過生物正交反應(yīng)與攜帶二苯基環(huán)辛炔(DBCO)的熒光探針形成穩(wěn)定連接,從而成功實(shí)現(xiàn)病毒的原位標(biāo)記。結(jié)果表明,DBCO-探針能夠高效、特異地捕獲N3-EV71病毒粒子實(shí)現(xiàn)病毒標(biāo)記,并且疊氮基團(tuán)的代謝修飾和熒光探針的原位標(biāo)記能有效保護(hù)病毒侵染活性,為后續(xù)病毒的動(dòng)態(tài)示蹤提供了可靠的技術(shù)手段。2.生物正交標(biāo)記動(dòng)態(tài)示蹤研究腸道病毒EV71的侵染機(jī)制。我們運(yùn)用SYTO染料與原位生物正交技術(shù)分別對(duì)病毒核酸與衣殼進(jìn)行無損標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)病毒雙重標(biāo)記與動(dòng)態(tài)示蹤。結(jié)果顯示,腸道病毒EV71與細(xì)胞表面清道夫受體結(jié)合后經(jīng)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞入胞,并在晚期內(nèi)涵體酸性環(huán)境中完成病毒核酸的快速釋放,闡明了EV71病毒的侵染過程與脫衣殼機(jī)制。本研究提出并建立了一種新型的基于氨基酸代謝的原位生物正交標(biāo)記技術(shù),并利用該技術(shù)對(duì)腸道病毒EV71進(jìn)行無損標(biāo)記與動(dòng)態(tài)示蹤,成功闡明其侵染機(jī)制,為相關(guān)抗病毒藥物的研制提供新的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R373.25
【圖文】：

第 1 章 引言足口病和腸道病毒 EV71足口�。℉andFootMouthDisease,HFMD）于 1957 年首次在新西蘭發(fā)現(xiàn)亞太地區(qū)流行[1,2]（如圖 1.1）[3]。HFMD 是一種常見于 5 歲以下幼兒的，通常被感染患者表現(xiàn)出惡心、嘔吐、低熱、厭食和手、足、口等部位或潰瘍等臨床癥狀[4]。HFMD 由腸道病毒感染引起，其中柯薩奇病毒 Asackievirus A16，CA16）和腸道病毒 EV71（Enterovirus 71, EV71）是主病原體，而且由腸道病毒 EV71 感染引起的 HFMD 可能發(fā)展為腦炎、急性弛緩性麻痹和心肺功能衰竭甚至死亡[5]。由于目前對(duì)腸道病毒 EV制缺乏深入研究，國家和社會(huì)對(duì)相關(guān)疾病的防控依然面臨巨大挑戰(zhàn)。

圖 1.2 腸道病毒 EV71 結(jié)構(gòu)與基因組示蹤的研究進(jìn)展宿主細(xì)胞是一個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)的復(fù)雜過程，主要包括：識(shí)裝和子代病毒釋放等過程。而常規(guī)的對(duì)病毒侵染機(jī)制連續(xù)觀察。近年來，隨著光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，病毒病毒感染機(jī)制的有效方法[9]，病毒感染機(jī)制的研究對(duì)染疾病具有重大意義。目前可用于病毒標(biāo)記示蹤的方直接化學(xué)偶聯(lián)或物理嵌合法，以及病毒自組裝法。程標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記法不僅應(yīng)用于病毒粒子的標(biāo)記，還常見于動(dòng)植物記[10]。病毒基因工程標(biāo)記法指將報(bào)告基因（熒光蛋白

在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察 HSV-1 組織趨作用。程標(biāo)記技術(shù)在理論上被認(rèn)為是最高效的病毒標(biāo)記方法不僅技術(shù)要求高而且操作過程繁雜甚至?xí)䦟?dǎo)于很大一部分熒光蛋白的錯(cuò)誤折疊、發(fā)色團(tuán)不成熟的熒光強(qiáng)度下降，這種情況在小尺寸病毒粒子中，體積較大的熒光蛋白（~27 kDa）往往會(huì)降低免上述蛋白基因融合所帶來的問題，部分研究者半胱氨酸短肽標(biāo)簽（TC-tag）修飾蛋白而后利用分研究者使用 20kDa 的 SNAP-tag 標(biāo)簽（人的氧型體），其可通過與芐基鳥嘌呤衍生物共價(jià)連接技術(shù)發(fā)展不成熟，尚未普遍用于病毒示蹤標(biāo)記研標(biāo)記[20]。

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本文編號(hào)：2764623