【摘要】：目的檢測(cè)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)上清液誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)凋亡過程中Krupple-like因子6(Krupple-like factor 6,KLF6)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)的表達(dá)水平,探討KLF6及iNOS在此凋亡過程中作用及機(jī)制。方法MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率篩選出適宜的濃度和作用時(shí)間,PA上清液根據(jù)濃度的不同分為對(duì)照組(加入等容積的完全培養(yǎng)基),15%PA組、30%PA組、45%PA組(PA濃度~([1])為PA上清液與完全培養(yǎng)的體積比),分別作用12h、24h。另設(shè)SMT(-)組(不加SMT)、SMT(+)組(SMT為iNOS阻斷劑,濃度根據(jù)說明書和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取6μM),根據(jù)MTT結(jié)果選取30%PA上清液作用細(xì)胞24h作為處理?xiàng)l件。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,Hoechst 33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化,Western blot檢測(cè)KLF6、iNOS蛋白的表達(dá)情況,熒光定量PCR檢測(cè)KLF6 mRNA、iNOS mRNA的表達(dá)水平,NO含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)NO含量,用SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果1、MTT結(jié)果顯示,RAW264.7的增殖率隨著PA上清液濃度的增加而增加,隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,篩選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)的作用時(shí)間是12h、24h。同濃度PA上清液作用12h、24h時(shí),細(xì)胞增殖率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。不同濃度PA上清液處理相同時(shí)間時(shí),細(xì)胞增殖率隨著濃度的增加而升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。說明PA上清液對(duì)RAW264.7細(xì)胞有增殖抑制作用,且抑制效應(yīng)呈時(shí)間-濃度依賴性。2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,RAW264.7細(xì)胞與不同濃度的PA上清液作用24h后,與對(duì)照組相比,RAW264.7的凋亡率隨著PA上清液濃度的增加而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。PA上清液可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的凋亡,且呈濃度依賴性。3、經(jīng)Hoechst 33342染色后,對(duì)照組RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色圓形或橢圓形,染色體均勻一致;經(jīng)不同濃度的PA上清液處理RAW264.7細(xì)胞24h后,細(xì)胞核固縮,深染,核內(nèi)可見濃染致密的塊狀顆粒,這些細(xì)胞核形態(tài)變化均為細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)。其中以45%PA組上清液處理組最為明顯,提示PA上清液誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡呈濃度依賴性。4、Western blot結(jié)果顯示,不同濃度的PA上清液分別感染RAW264.7細(xì)胞24h后,KLF6、iNOS蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。30%PA組感染RAW264.7細(xì)胞12h、24h后,KLF6、iNOS表達(dá)水平均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5、熒光定量PCR結(jié)果顯示,不同濃度的PA組處理RAW264.7細(xì)胞24h后,細(xì)胞中KLF6 mRNA、iNOS mRNA分子表達(dá)水平均高于對(duì)照組,且呈濃度依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。30%PA組感染RAW264.7細(xì)胞12h、24h后,細(xì)胞中KLF6 mRNA、iNOS mRNA分子表達(dá)水平均高于對(duì)照組,且呈時(shí)間依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6、NO含量檢測(cè)結(jié)果示,不同濃度的PA組感染RAW264.7細(xì)胞24h后,細(xì)胞上清液中的NO含量隨著PA上清液濃度的增加而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。30%PA組感染RAW264.7細(xì)胞12h、24h后,細(xì)胞上清液中的NO含量隨著PA上清液作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。7、SMT(+)組的細(xì)胞,經(jīng)30%PA上清液處理24h后,與SMT(-)組相比,RAW264.7細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)水平有所降低(P0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞上清液中的NO含量,與SMT(-)組相比,NO含量有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。SMT阻斷iNOS生成后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)PA上清液感染的RAW264.7細(xì)胞的凋亡率,與SMT(-)組相比,細(xì)胞凋亡率明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論1、PA上清液能抑制RAW264.7細(xì)胞增殖,且其抑制效應(yīng)呈濃度-時(shí)間依賴關(guān)系。2、PA上清液誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是KLF6調(diào)控iNOS產(chǎn)生過量的NO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。3、iNOS表達(dá)的減少對(duì)于PA上清液感染RAW264.7細(xì)胞引起的細(xì)胞毒性起到一定的保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

：與同濃度PA上清液6h組相比，&P<0.05；與同濃度PA上清液12h組相比，○P<0.PA上清液24h組相比，●P<0.05 7-2 不同濃度 PA 上清液對(duì) RAW264.7 細(xì)胞增殖率的影響（ x ±s，n=組別 6h 12h 24h 48h對(duì)照組 0 0 0 0%PA組 3.17±1.89 12.97±0.63**32.19±3.23**44.88±7% PA組 3.6±0.53*27.47±2.13**#48.14±3.85**#58±4.5% PA組 7.02±0.6*▲49.17±3.92**#▲63.79±3.73**#▲79.73±6.F值 21.251 175.212 152.058 76.10P值 0.000 0.000 0.000 0.00：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與15%PA組相比，#P<0.05；與30%PA組相05；

0 103104105105105110410411031031031030000010-310-310-310-30% PA supernatant45% PA supernPIPIPInexinAVPI

PA 上清液作用 RAW264.7 細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化 Hoechst 33342 染色后，對(duì)照組 RAW264.7 細(xì)胞的細(xì)胞核呈藍(lán)色圓形染色體均勻一致；經(jīng)濃度為（15%、30%、45%）的 PA 上清液處理 RAW24h 后，細(xì)胞核固縮，深染，核內(nèi)可見濃染致密的塊狀顆粒，這些細(xì)胞均為細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)，其中以 45% PA 組處理組最為明顯，見圖 3。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李穎;柴文戍;劉硯;寧學(xué)聰;;銅綠假單胞菌上清液誘導(dǎo)J774細(xì)胞凋亡過程中凋亡誘導(dǎo)因子的表達(dá)[J];山東醫(yī)藥;2010年41期

本文編號(hào)：2763698