【摘要】：冠狀動脈疾病已經成為目前威脅人類健康的主要疾病,冠狀動脈血管平滑肌不僅在冠狀動脈的發(fā)生發(fā)育中有著重要的作用,還參與了冠狀動脈血管結構的組成及功能的發(fā)揮。因此,充分了解冠狀動脈血管平滑肌細胞的起源對于探索更多更有效的冠狀動脈血管疾病治療方法有著重要的意義。心外膜祖細胞(Epicardial progenitor cells,EpiCs),是一個表達Tbx18、WT1和Tcf21等轉錄因子的祖細胞池,是心臟發(fā)育過程中第一、第二生心區(qū)的重要補充,因此也被認為是心臟的第三心生區(qū)。心外膜祖細胞在心臟發(fā)育及血管的生成中具有不可或缺的作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)心外膜祖細胞是冠狀動脈血管平滑肌細胞的來源之一。同時還發(fā)現(xiàn)心外膜祖細胞還可以分化為成纖維細胞、內皮細胞、竇房結細胞等。S1P是一種具有多種生物學功能的脂質,主要通過與五種G蛋白偶聯(lián)受體結合發(fā)揮作用。S1P受體在體內廣泛分布,其中以S1P_1、S1P_2、S1P_3三種受體的分布最為廣泛,在心血管系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育中具有重要的作用,還通過多種信號通路調節(jié)平滑肌細胞的功能,包括增殖、遷移、分化等功能。既往的研究發(fā)現(xiàn)S1P可以誘導脂肪來源的間質細胞及中胚層成血管細胞分化為平滑肌細胞。心外膜祖細胞具有分化為平滑肌細胞的潛能,而S1P可以誘導細胞分化為平滑肌細胞,進而我們推測S1P可能具有誘導心外膜祖細胞分化為平滑肌細胞的功能,明確S1P這一誘導分化作用對尋找新的冠狀動脈血管疾病的治療方法具有一定的臨床價值。因此,在本研究中我們探索了S1P誘導心外膜祖細胞向平滑肌細胞分化的作用,并檢測了可能參與這一作用S1P受體。第一部分:心外膜祖細胞的提取及鑒定目的:建立體外E11.5天心外膜祖細胞的培養(yǎng)模型,檢測培養(yǎng)心外膜祖細胞上S1P受體的表達情況,為探討心外膜祖細胞的分化作用做好研究基礎。方法:通過獲取E11.5天胚胎心室組織進行種植,并從組織邊緣爬出心外膜祖細胞的方法建立心外膜祖細胞的體外培養(yǎng)模型。PCR及細胞免疫熒光的方法檢測心外膜祖細胞特異性標志物Tbx18及WT1轉錄因子的表達。通過PCR的方法檢測心外膜祖細胞上各S1P受體的表達情況。結果:實驗提取的細胞高表達轉錄因子Tbx18及WT1,低表達cTnT,細胞形態(tài)呈“鋪路石”樣排列生長。提取細胞主要表達S1P_1、S1P_2、S1P_3受體,幾乎不表達S1P_4、S1P_5受體。結論:實驗所提取的原代細胞為心外膜祖細胞,且細胞純度高,成功建立了心外膜祖細胞的體外培養(yǎng)模型。明確了S1P受體在心外膜祖細胞的表達,為之后探討S1P通過其受體發(fā)揮的誘導分化作用奠定了研究基礎。第二部分:S1P誘導心外膜祖細胞向平滑肌細胞分化目的:探討S1P誘導心外膜祖細胞向平滑肌細胞分化及其機制。方法:建立心外膜祖細胞的體外培養(yǎng)模型,用不同濃度的S1P(0.1uM、0.5uM、1uM、2uM、5uM)處理細胞,通過qRT-PCR方法檢測平滑肌細胞標志物α-SMA及MYH11的表達情況,篩選出S1P藥物干預的最佳刺激濃度。將培養(yǎng)的心外膜祖細胞進行隨機分組,即對照組、S1P組(0.5uM S1P)、S1P+JTE013組(0.5uM S1P+1uM JTE013)、S1P+VPC23019組(0.5uM S1P+1uM VPC23019),通過qRT-PCR及免疫熒光的方法檢測平滑肌細胞標志物α-SMA及MYH11的表達情況,探索S1P_1、S1P_2、S1P_3受體抑制后對S1P誘導分化作用的作用。再次將培養(yǎng)細胞隨機分組為:對照組、S1P組(0.5uM S1P)、SEW2871組(30uM SEW2871)及S1P+W146組(0.5uM S1P+10uM W146),通過qRT-PCR及免疫熒光的方法檢測α-SMA及MYH11的表達情況,探討S1P_1受體在誘導分化中的作用。制備三維膠原凝膠模型,通過凝膠收縮實驗觀察不同處理方法干預細胞后膠原的收縮情況。結果:S1P藥物干預心外膜祖細胞6天后,當S1P干預濃度為0.5uM時,α-SMA及MYH11的表達量達到峰值,說明0.5uM濃度為S1P干預的最佳刺激濃度。S1P_2受體的抑制劑JTE013和S1P_1/S1P_3受體的抑制劑VPC23019預處理心外膜祖細胞后,qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)這兩種方式干預細胞后的α-SMA及MYH11表達量較單獨S1P處理的表達量明顯降低,且VPC23019處理后這兩種平滑肌細胞標志物的表達量降低更加明顯。細胞免疫熒光也得到了同樣結果。S1P_1受體的激動劑SEW2871干預心外膜祖細胞后,mRNA水平α-SMA及MYH11表達量與對照組相比較并沒有增加。用S1P_1受體抑制劑W146預處理心外膜祖細胞后,α-SMA及MYH11表達量較S1P組沒有明顯的差異。免疫熒光也支持上述結果。S1P處理后的細胞制備膠原凝膠,再用卡巴膽堿刺激后可見凝膠明顯收縮。S1P+W146組的凝膠也明顯收縮,S1P+JTE013組及S1P+VPC23019組凝膠未發(fā)生明顯的收縮。SEW2871組凝膠未發(fā)生收縮。結論:S1P可以誘導心外膜祖細胞向平滑肌細胞分化,在S1P的誘導分化中S1P_3受體起主要作用,S1P_2受體起次要作用。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R329.2
【圖文】：

高倍鏡下觀察細胞形態(tài)更為清楚，細胞融合排列（圖1-C）。圖 1 心外膜祖細胞的培養(yǎng)。A、B 均為低倍鏡下所見視野，C 為高倍鏡下所見視野。Figure 1 The culture of epicardial progenitor cells. (A-B) Morphology of EpiCs observed underlow power microscope after 24 h culture (×200); (C) EpiCs under high power microscope(×400).2.2 心外膜祖細胞的鑒定為了鑒定實驗所提取的細胞，并明確提取細胞的純度，實驗中采用了 qRT-PCR及細胞免疫熒光兩種方法。以原代心肌細胞為對照，圖 2 中可見，實驗所提取的細胞高表達 Tbx18 和 WT1 兩種轉錄因子，低表達心肌細胞標志物 cTnT。同時細胞免疫熒光的結果可見提取細胞高表達心外膜祖細胞標志物Tbx18和WT1（圖3）。用 PBS 作用抗體的陰性對照，以此說明抗體的特異性。綜合以上實驗結果可以證實實驗所提取的細胞為心外膜祖細胞。A BC2 結果

圖 2 Tbx18、WT1 及 cTnT 在心外膜祖細胞及心肌細胞中的表達。e mRNA expression levels of Tbx18、WT1 and cTnT in EpiCs and ca圖 3 心外膜祖細胞標志物 Tbx18 和 WT1 的表達（標尺為 500 μm）。e Immunofluorescence staining of Tbx18 and WT1 in EpiCs. (Scale b

及細胞免疫熒光兩種方法。以原代心肌細胞為對照，圖 2 中可見，實驗所提取的細胞高表達 Tbx18 和 WT1 兩種轉錄因子，低表達心肌細胞標志物 cTnT。同時細胞免疫熒光的結果可見提取細胞高表達心外膜祖細胞標志物Tbx18和WT1（圖3）。用 PBS 作用抗體的陰性對照，以此說明抗體的特異性。綜合以上實驗結果可以證實實驗所提取的細胞為心外膜祖細胞。A BC2 結果

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