【摘要】：冠狀動(dòng)脈疾病已經(jīng)成為目前威脅人類健康的主要疾病,冠狀動(dòng)脈血管平滑肌不僅在冠狀動(dòng)脈的發(fā)生發(fā)育中有著重要的作用,還參與了冠狀動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)的組成及功能的發(fā)揮。因此,充分了解冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的起源對(duì)于探索更多更有效的冠狀動(dòng)脈血管疾病治療方法有著重要的意義。心外膜祖細(xì)胞(Epicardial progenitor cells,EpiCs),是一個(gè)表達(dá)Tbx18、WT1和Tcf21等轉(zhuǎn)錄因子的祖細(xì)胞池,是心臟發(fā)育過程中第一、第二生心區(qū)的重要補(bǔ)充,因此也被認(rèn)為是心臟的第三心生區(qū)。心外膜祖細(xì)胞在心臟發(fā)育及血管的生成中具有不可或缺的作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)心外膜祖細(xì)胞是冠狀動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞的來源之一。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)心外膜祖細(xì)胞還可以分化為成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、竇房結(jié)細(xì)胞等。S1P是一種具有多種生物學(xué)功能的脂質(zhì),主要通過與五種G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合發(fā)揮作用。S1P受體在體內(nèi)廣泛分布,其中以S1P_1、S1P_2、S1P_3三種受體的分布最為廣泛,在心血管系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育中具有重要的作用,還通過多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的功能,包括增殖、遷移、分化等功能。既往的研究發(fā)現(xiàn)S1P可以誘導(dǎo)脂肪來源的間質(zhì)細(xì)胞及中胚層成血管細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞。心外膜祖細(xì)胞具有分化為平滑肌細(xì)胞的潛能,而S1P可以誘導(dǎo)細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞,進(jìn)而我們推測(cè)S1P可能具有誘導(dǎo)心外膜祖細(xì)胞分化為平滑肌細(xì)胞的功能,明確S1P這一誘導(dǎo)分化作用對(duì)尋找新的冠狀動(dòng)脈血管疾病的治療方法具有一定的臨床價(jià)值。因此,在本研究中我們探索了S1P誘導(dǎo)心外膜祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化的作用,并檢測(cè)了可能參與這一作用S1P受體。第一部分:心外膜祖細(xì)胞的提取及鑒定目的:建立體外E11.5天心外膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)模型,檢測(cè)培養(yǎng)心外膜祖細(xì)胞上S1P受體的表達(dá)情況,為探討心外膜祖細(xì)胞的分化作用做好研究基礎(chǔ)。方法:通過獲取E11.5天胚胎心室組織進(jìn)行種植,并從組織邊緣爬出心外膜祖細(xì)胞的方法建立心外膜祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型。PCR及細(xì)胞免疫熒光的方法檢測(cè)心外膜祖細(xì)胞特異性標(biāo)志物Tbx18及WT1轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。通過PCR的方法檢測(cè)心外膜祖細(xì)胞上各S1P受體的表達(dá)情況。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)提取的細(xì)胞高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Tbx18及WT1,低表達(dá)cTnT,細(xì)胞形態(tài)呈“鋪路石”樣排列生長(zhǎng)。提取細(xì)胞主要表達(dá)S1P_1、S1P_2、S1P_3受體,幾乎不表達(dá)S1P_4、S1P_5受體。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)所提取的原代細(xì)胞為心外膜祖細(xì)胞,且細(xì)胞純度高,成功建立了心外膜祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型。明確了S1P受體在心外膜祖細(xì)胞的表達(dá),為之后探討S1P通過其受體發(fā)揮的誘導(dǎo)分化作用奠定了研究基礎(chǔ)。第二部分:S1P誘導(dǎo)心外膜祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化目的:探討S1P誘導(dǎo)心外膜祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化及其機(jī)制。方法:建立心外膜祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型,用不同濃度的S1P(0.1uM、0.5uM、1uM、2uM、5uM)處理細(xì)胞,通過qRT-PCR方法檢測(cè)平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA及MYH11的表達(dá)情況,篩選出S1P藥物干預(yù)的最佳刺激濃度。將培養(yǎng)的心外膜祖細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組,即對(duì)照組、S1P組(0.5uM S1P)、S1P+JTE013組(0.5uM S1P+1uM JTE013)、S1P+VPC23019組(0.5uM S1P+1uM VPC23019),通過qRT-PCR及免疫熒光的方法檢測(cè)平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA及MYH11的表達(dá)情況,探索S1P_1、S1P_2、S1P_3受體抑制后對(duì)S1P誘導(dǎo)分化作用的作用。再次將培養(yǎng)細(xì)胞隨機(jī)分組為:對(duì)照組、S1P組(0.5uM S1P)、SEW2871組(30uM SEW2871)及S1P+W146組(0.5uM S1P+10uM W146),通過qRT-PCR及免疫熒光的方法檢測(cè)α-SMA及MYH11的表達(dá)情況,探討S1P_1受體在誘導(dǎo)分化中的作用。制備三維膠原凝膠模型,通過凝膠收縮實(shí)驗(yàn)觀察不同處理方法干預(yù)細(xì)胞后膠原的收縮情況。結(jié)果:S1P藥物干預(yù)心外膜祖細(xì)胞6天后,當(dāng)S1P干預(yù)濃度為0.5uM時(shí),α-SMA及MYH11的表達(dá)量達(dá)到峰值,說明0.5uM濃度為S1P干預(yù)的最佳刺激濃度。S1P_2受體的抑制劑JTE013和S1P_1/S1P_3受體的抑制劑VPC23019預(yù)處理心外膜祖細(xì)胞后,qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這兩種方式干預(yù)細(xì)胞后的α-SMA及MYH11表達(dá)量較單獨(dú)S1P處理的表達(dá)量明顯降低,且VPC23019處理后這兩種平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)量降低更加明顯。細(xì)胞免疫熒光也得到了同樣結(jié)果。S1P_1受體的激動(dòng)劑SEW2871干預(yù)心外膜祖細(xì)胞后,mRNA水平α-SMA及MYH11表達(dá)量與對(duì)照組相比較并沒有增加。用S1P_1受體抑制劑W146預(yù)處理心外膜祖細(xì)胞后,α-SMA及MYH11表達(dá)量較S1P組沒有明顯的差異。免疫熒光也支持上述結(jié)果。S1P處理后的細(xì)胞制備膠原凝膠,再用卡巴膽堿刺激后可見凝膠明顯收縮。S1P+W146組的凝膠也明顯收縮,S1P+JTE013組及S1P+VPC23019組凝膠未發(fā)生明顯的收縮。SEW2871組凝膠未發(fā)生收縮。結(jié)論:S1P可以誘導(dǎo)心外膜祖細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化,在S1P的誘導(dǎo)分化中S1P_3受體起主要作用,S1P_2受體起次要作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R329.2
【圖文】：

高倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)更為清楚，細(xì)胞融合排列（圖1-C）。圖 1 心外膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)。A、B 均為低倍鏡下所見視野，C 為高倍鏡下所見視野。Figure 1 The culture of epicardial progenitor cells. (A-B) Morphology of EpiCs observed underlow power microscope after 24 h culture (×200); (C) EpiCs under high power microscope(×400).2.2 心外膜祖細(xì)胞的鑒定為了鑒定實(shí)驗(yàn)所提取的細(xì)胞，并明確提取細(xì)胞的純度，實(shí)驗(yàn)中采用了 qRT-PCR及細(xì)胞免疫熒光兩種方法。以原代心肌細(xì)胞為對(duì)照，圖 2 中可見，實(shí)驗(yàn)所提取的細(xì)胞高表達(dá) Tbx18 和 WT1 兩種轉(zhuǎn)錄因子，低表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物 cTnT。同時(shí)細(xì)胞免疫熒光的結(jié)果可見提取細(xì)胞高表達(dá)心外膜祖細(xì)胞標(biāo)志物Tbx18和WT1（圖3）。用 PBS 作用抗體的陰性對(duì)照，以此說明抗體的特異性。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)實(shí)驗(yàn)所提取的細(xì)胞為心外膜祖細(xì)胞。A BC2 結(jié)果

圖 2 Tbx18、WT1 及 cTnT 在心外膜祖細(xì)胞及心肌細(xì)胞中的表達(dá)。e mRNA expression levels of Tbx18、WT1 and cTnT in EpiCs and ca圖 3 心外膜祖細(xì)胞標(biāo)志物 Tbx18 和 WT1 的表達(dá)（標(biāo)尺為 500 μm）。e Immunofluorescence staining of Tbx18 and WT1 in EpiCs. (Scale b

及細(xì)胞免疫熒光兩種方法。以原代心肌細(xì)胞為對(duì)照，圖 2 中可見，實(shí)驗(yàn)所提取的細(xì)胞高表達(dá) Tbx18 和 WT1 兩種轉(zhuǎn)錄因子，低表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物 cTnT。同時(shí)細(xì)胞免疫熒光的結(jié)果可見提取細(xì)胞高表達(dá)心外膜祖細(xì)胞標(biāo)志物Tbx18和WT1（圖3）。用 PBS 作用抗體的陰性對(duì)照，以此說明抗體的特異性。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證實(shí)實(shí)驗(yàn)所提取的細(xì)胞為心外膜祖細(xì)胞。A BC2 結(jié)果

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本文編號(hào)：2762643