發(fā)布時(shí)間：2020-07-19 13:49

【摘要】：研究背景:當(dāng)前人們工作競(jìng)爭(zhēng)激烈,生活節(jié)奏加快,不可避免地處于應(yīng)激狀態(tài)。持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)會(huì)對(duì)人體的正常生理機(jī)能造成嚴(yán)重影響,進(jìn)而導(dǎo)致多種疾病發(fā)生發(fā)展,其中就包括疲勞~([1])。疲勞以及過(guò)勞已經(jīng)日益成為全球性公共健康問(wèn)題。長(zhǎng)期的疲勞會(huì)造成學(xué)習(xí)記憶能力下降和及工作效率低下,影響人們正常生活,甚至可能引發(fā)安全生產(chǎn)問(wèn)題。特別在高強(qiáng)度的軍事沖突或非戰(zhàn)爭(zhēng)軍事行動(dòng)中,疲勞應(yīng)激損傷嚴(yán)重影響戰(zhàn)士身體健康。因此研究疲勞發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相關(guān)機(jī)制,并開發(fā)有效的抗疲勞藥物具有非常重要的科學(xué)意義和社會(huì)意義。疲勞發(fā)生的病理生理機(jī)制復(fù)雜,目前尚不明確�，F(xiàn)有的觀點(diǎn)認(rèn)為,疲勞的發(fā)生是神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)等多因素共同參與的結(jié)果~([2])。研究表明疲勞發(fā)生發(fā)展過(guò)程中免疫系統(tǒng)異常激活,體內(nèi)多種炎癥因子水平(如白介素-1β,IL-1β等)顯著升高,并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生疲勞樣癥狀~([3])。炎癥小體的研究近年來(lái)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。NLRP3炎癥小體是機(jī)體固有免疫的重要組成部分,它可以通過(guò)自身的NOD樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors)識(shí)別損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)以及病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),進(jìn)而激活下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答~([4])。當(dāng)被激活時(shí),NOD樣受體將募集凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)和半胱天冬氨酸蛋白酶前體pro-Caspase-1形成多蛋白復(fù)合體,即NLRP3炎癥小體。活化的NLRP3炎癥小體可以切割pro-Caspase-1生成活化的Caspase-1,活化的Caspase-1可以切割I(lǐng)L-1β及IL-18前體并生成有活性的IL-1β及IL-18,并分泌到胞外,發(fā)揮致炎作用。炎癥小體的適當(dāng)活化可以抵抗病原體感染和減輕應(yīng)激損傷,但是當(dāng)其活化失控時(shí)也能造成炎癥效應(yīng)的放大和器官損傷~([5])。目前已有研究發(fā)現(xiàn),慢性疲勞綜合癥(chronic fatigue syndrome,CFS)患者的血清中IL-1β水平顯著升高,而IL-1β是NLRP3炎癥小體活化后的重要產(chǎn)物,因此我們推測(cè)NLRP3炎癥小體可能參與了疲勞的發(fā)生發(fā)展。但是對(duì)于NLRP3炎癥小體是否參與疲勞的發(fā)生發(fā)展,以及涉及的具體機(jī)制目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此深入研究NLRP3炎癥小體在疲勞發(fā)生中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制,對(duì)于闡述疲勞的發(fā)生機(jī)制,以及提出新的疲勞防治策略具有重要意義。研究目的:本研究擬利用急性疲勞和慢性疲勞兩種小鼠模型,檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NLRP3炎癥小體的激活水平;利用Nlrp3基因敲除(Nlrp3~(-/-))小鼠明確NLRP3炎癥小體在疲勞發(fā)生中的作用;檢測(cè)活性氧水平,闡明NLRP3炎性小體激活的活性氧機(jī)制;最后應(yīng)用Ω-3不飽和脂肪酸對(duì)上述疲勞模型進(jìn)行干預(yù),驗(yàn)證NLRP3炎癥小體和活性氧在改善和治療疲勞過(guò)程中的作用。研究方法:本課題首先探索建立了(1)急性疲勞模型:脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)復(fù)合強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的小鼠疲勞模型;(2)慢性疲勞模型:反復(fù)強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的小鼠疲勞模型。選擇小鼠的自發(fā)活動(dòng)距離和轉(zhuǎn)棒儀在棒時(shí)間作為其疲勞狀態(tài)的行為學(xué)指標(biāo),判定疲勞模型是否成功以及小鼠的疲勞程度。然后以小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為研究靶器官,檢測(cè)NLRP3炎癥小體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的激活水平。再次對(duì)Nlrp3~(-/-)小鼠進(jìn)行相同的疲勞模型建模處理,并檢測(cè)包括自發(fā)活動(dòng)距離和轉(zhuǎn)棒儀在棒時(shí)間在內(nèi)的行為學(xué)指標(biāo)。同時(shí)檢測(cè)野生型和基因敲除型小鼠腦中活性氧的生成情況,探究NLRP3炎癥小體活化的具體機(jī)制。最后,選用Ω-3不飽和脂肪酸—DHA對(duì)反復(fù)強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的小鼠疲勞進(jìn)行干預(yù),進(jìn)一步驗(yàn)證NLRP3炎癥小體作為疲勞治療靶點(diǎn)的價(jià)值。研究結(jié)果:1、NLRP3炎癥小體參與了LPS復(fù)合強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的小鼠急性疲勞模型1.1成功建立小鼠急性疲勞模型,建立的方法是先在小鼠腹腔注射3 mg/Kg LPS然后進(jìn)行強(qiáng)迫游泳20min,小鼠出現(xiàn)了明顯疲勞樣行為,表現(xiàn)為小鼠自發(fā)活動(dòng)距離縮短,轉(zhuǎn)棒儀在棒時(shí)間縮短,說(shuō)明模型建立成功。1.2該疲勞模型小鼠血清IL-1β和IL-6含量的升高,腦中NLRP3和Pro-IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)水平升高,免疫熒光結(jié)果顯示NLRP3炎癥小體組裝形成并激活。1.3與野生型小鼠相比,Nlrp3~(-/-)小鼠在LPS復(fù)合強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)下所表現(xiàn)的疲勞行為顯著減輕。Nlrp3~(-/-)小鼠在相同的LPS復(fù)合強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)下腦組織中Caspase-1酶的激活顯著減少,并伴有IL-1β水平的明顯降低。2、NLRP3炎癥小體參與了反復(fù)強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的小鼠慢性疲勞模型2.1成功建立小鼠慢性疲勞模型,通過(guò)反復(fù)強(qiáng)迫游泳,負(fù)重每12 h游泳10min,連續(xù)持續(xù)14天,建立了慢性疲勞模型。反復(fù)強(qiáng)迫游泳可以誘導(dǎo)野生型小鼠產(chǎn)生明顯的疲勞樣行為,表現(xiàn)為小鼠自發(fā)活動(dòng)距離縮短,轉(zhuǎn)棒儀在棒時(shí)間縮短,與之相比,Nlrp3~(-/-)小鼠的疲勞樣行為明顯減輕。2.2反復(fù)強(qiáng)迫游泳建立的慢性疲勞模型,野生型小鼠大腦前額葉皮質(zhì)腦區(qū)的NLRP3炎癥小體顯著組裝并活化,IL-1β水平顯著升高。和野生型疲勞小鼠相比,Nlrp3~(-/-)小鼠的疲勞樣行為顯著減輕,并伴有前額葉皮質(zhì)腦區(qū)和血清中IL-1β的水平顯著降低。2.3在反復(fù)強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的疲勞下,野生型和Nlrp3~(-/-)小鼠腦中的活性氧水平,血清中丙二醛都顯著升高,但在野生型和Nlrp3~(-/-)小鼠之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3、Ω-3不飽和脂肪酸在反復(fù)強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的小鼠疲勞模型中的作用及其可能機(jī)制3.1Ω-3不飽和脂肪酸可以明顯改善反復(fù)強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的小鼠疲勞樣行為,小鼠自發(fā)活動(dòng)距離和轉(zhuǎn)幫儀在棒時(shí)間顯著延長(zhǎng)。3.2Ω-3不飽和脂肪酸通過(guò)抑制反復(fù)強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的疲勞小鼠前額葉皮質(zhì)腦區(qū)中NLRP3炎癥小體的組裝激活、IL-1β的升高以及疲勞小鼠腦中活性氧的生成來(lái)改善疲勞狀態(tài)。結(jié)論:本課題發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)NLRP3炎癥小體激活導(dǎo)致兩種不同模型的疲勞發(fā)生;NLRP3-IL-1β通路在疲勞發(fā)生過(guò)程中起重要作用。Ω-3不飽和脂肪酸通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體的激活和活性氧的生成,進(jìn)而緩解小鼠疲勞樣行為。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R363
【圖文】：

疲勞模型導(dǎo)致小鼠自發(fā)活動(dòng)距離縮短，轉(zhuǎn)棒儀在棒時(shí)間縮短，表現(xiàn)出了明顯的疲勞樣行為，表示模型建立成功。因此本研究采用 LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳的方法來(lái)建立模型，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。2、LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳建立小鼠疲勞模型的炎癥因子水平和生化指標(biāo)除了上述行為學(xué)實(shí)驗(yàn)外，我們檢測(cè)了小鼠血清的乳酸、丙二醛（MDA），并同時(shí)檢測(cè)小鼠肌肉中 MDA 的水平，小鼠血清中炎癥因子 IL-1β、IL-6 的水平以了解小鼠的體內(nèi)的炎癥狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清中乳酸、MDA 的水平在 4 個(gè)組之間并沒有顯著性差異（圖 2.A、圖 2.B，p>0.05），肌肉中 MDA 的水平在 4 個(gè)組之間也沒有顯著性差異（圖 2.C，p>0.05）。與空白對(duì)照組相比，LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳組小鼠血清中 IL-1β 和 IL-6 的水平顯著升高（圖 2.D、圖 2.E， p<0.01），LPS 組和強(qiáng)迫游泳組的炎癥因子水平則沒有顯著變化（圖 2.D、圖 2.E，p>0.05）。上述結(jié)果表明，LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳組小鼠不僅表現(xiàn)出明顯的疲勞樣行為，并且伴有血清中 IL-1β 和 IL-6 的水平顯著升高，表明該模型伴隨有一定程度的體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

NLRP3 炎癥小體在小鼠疲勞樣行為中的作用及分子機(jī)制LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳后，小鼠產(chǎn)生明顯的疲勞樣行為。（A）在自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，以 10 分鐘為間隔監(jiān)測(cè)小鼠自發(fā)活動(dòng) 1 小時(shí)。與空白對(duì)照組相比，LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳組的自發(fā)活動(dòng)距離顯著減少。（B）在轉(zhuǎn)棒儀在棒時(shí)間上，相較于空白對(duì)照組，LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳組的在棒時(shí)間也明顯縮短。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（mean ±SEM）。* p<0.05，** p <0.01 vs 空白對(duì)照組（ANOVA）。（n = 5 ~ 8）。

強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的疲勞小鼠腦中 Caspase-1 p10 的蛋白水平也明顯升高（圖 4C，p<0.01）。上述結(jié)果表明，LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳可以使小鼠腦中 NLRP3 蛋白表達(dá)明顯升高，Caspase-10 并且 NLRP3 炎癥小體活化的產(chǎn)物 IL-1β 也顯著提高，表明IL-1β 的升高有可能和 NLRP3 炎癥小體的激活有關(guān)。3、LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的疲勞小鼠中腦中 NLRP3 炎癥小體的組裝和激活情況同時(shí)為了更加直觀地反映 NLRP3 炎癥小體的組裝狀態(tài)，本研究應(yīng)用了免疫熒光染色的方法，將細(xì)胞核標(biāo)記為藍(lán)色，NLRP3 蛋白標(biāo)記為綠色，IL-1β 標(biāo)記為紅色，當(dāng) NLRP3 和 IL-1β 相互聚集時(shí)，會(huì)合成顯色為黃色，表示 NLRP3 炎癥小體處在組裝狀態(tài)，表示 NLRP3 炎癥小體激活。結(jié)果表明 LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的疲勞小鼠的腦區(qū)切片中的黃色區(qū)域明顯增多，提示 NLRP3 炎癥小體處于激活狀態(tài)（圖 4D）。以上結(jié)果表明 NLRP3 炎癥小體和 LPS 復(fù)合強(qiáng)迫游泳誘導(dǎo)的疲勞小鼠導(dǎo)致的疲勞行為密切相關(guān)，因此，接下來(lái)用 Nlrp3-/-小鼠來(lái)驗(yàn)證基因敲除以后，小鼠的疲勞行為是否有改善。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Shu-Long Wang;Ge Zhao;Wei Zhu;Xiao-Meng Dong;Ting Liu;Yuan-Yuan Li;Wen-Gang Song;Yi-Qiang Wang;;Herpes simplex virus-1 infection or Simian virus 40-mediated immortalization of corneal cells causes permanent translocation of NLRP3 to the nuclei[J];International Journal of Ophthalmology;2015年01期

本文編號(hào)：2762506