【摘要】：研究背景:當前人們工作競爭激烈,生活節(jié)奏加快,不可避免地處于應(yīng)激狀態(tài)。持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)會對人體的正常生理機能造成嚴重影響,進而導(dǎo)致多種疾病發(fā)生發(fā)展,其中就包括疲勞~([1])。疲勞以及過勞已經(jīng)日益成為全球性公共健康問題。長期的疲勞會造成學(xué)習(xí)記憶能力下降和及工作效率低下,影響人們正常生活,甚至可能引發(fā)安全生產(chǎn)問題。特別在高強度的軍事沖突或非戰(zhàn)爭軍事行動中,疲勞應(yīng)激損傷嚴重影響戰(zhàn)士身體健康。因此研究疲勞發(fā)生發(fā)展過程中的相關(guān)機制,并開發(fā)有效的抗疲勞藥物具有非常重要的科學(xué)意義和社會意義。疲勞發(fā)生的病理生理機制復(fù)雜,目前尚不明確�，F(xiàn)有的觀點認為,疲勞的發(fā)生是神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及內(nèi)分泌系統(tǒng)等多因素共同參與的結(jié)果~([2])。研究表明疲勞發(fā)生發(fā)展過程中免疫系統(tǒng)異常激活,體內(nèi)多種炎癥因子水平(如白介素-1β,IL-1β等)顯著升高,并作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),誘導(dǎo)機體產(chǎn)生疲勞樣癥狀~([3])。炎癥小體的研究近年來受到了越來越多的關(guān)注。NLRP3炎癥小體是機體固有免疫的重要組成部分,它可以通過自身的NOD樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors)識別損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)以及病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),進而激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答~([4])。當被激活時,NOD樣受體將募集凋亡相關(guān)斑點樣蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)和半胱天冬氨酸蛋白酶前體pro-Caspase-1形成多蛋白復(fù)合體,即NLRP3炎癥小體�；罨腘LRP3炎癥小體可以切割pro-Caspase-1生成活化的Caspase-1,活化的Caspase-1可以切割I(lǐng)L-1β及IL-18前體并生成有活性的IL-1β及IL-18,并分泌到胞外,發(fā)揮致炎作用。炎癥小體的適當活化可以抵抗病原體感染和減輕應(yīng)激損傷,但是當其活化失控時也能造成炎癥效應(yīng)的放大和器官損傷~([5])。目前已有研究發(fā)現(xiàn),慢性疲勞綜合癥(chronic fatigue syndrome,CFS)患者的血清中IL-1β水平顯著升高,而IL-1β是NLRP3炎癥小體活化后的重要產(chǎn)物,因此我們推測NLRP3炎癥小體可能參與了疲勞的發(fā)生發(fā)展。但是對于NLRP3炎癥小體是否參與疲勞的發(fā)生發(fā)展,以及涉及的具體機制目前尚無文獻報道。因此深入研究NLRP3炎癥小體在疲勞發(fā)生中的作用及其相關(guān)分子機制,對于闡述疲勞的發(fā)生機制,以及提出新的疲勞防治策略具有重要意義。研究目的:本研究擬利用急性疲勞和慢性疲勞兩種小鼠模型,檢測中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NLRP3炎癥小體的激活水平;利用Nlrp3基因敲除(Nlrp3~(-/-))小鼠明確NLRP3炎癥小體在疲勞發(fā)生中的作用;檢測活性氧水平,闡明NLRP3炎性小體激活的活性氧機制;最后應(yīng)用Ω-3不飽和脂肪酸對上述疲勞模型進行干預(yù),驗證NLRP3炎癥小體和活性氧在改善和治療疲勞過程中的作用。研究方法:本課題首先探索建立了(1)急性疲勞模型:脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)復(fù)合強迫游泳誘導(dǎo)的小鼠疲勞模型;(2)慢性疲勞模型:反復(fù)強迫游泳誘導(dǎo)的小鼠疲勞模型。選擇小鼠的自發(fā)活動距離和轉(zhuǎn)棒儀在棒時間作為其疲勞狀態(tài)的行為學(xué)指標,判定疲勞模型是否成功以及小鼠的疲勞程度。然后以小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為研究靶器官,檢測NLRP3炎癥小體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的激活水平。再次對Nlrp3~(-/-)小鼠進行相同的疲勞模型建模處理,并檢測包括自發(fā)活動距離和轉(zhuǎn)棒儀在棒時間在內(nèi)的行為學(xué)指標。同時檢測野生型和基因敲除型小鼠腦中活性氧的生成情況,探究NLRP3炎癥小體活化的具體機制。最后,選用Ω-3不飽和脂肪酸—DHA對反復(fù)強迫游泳誘導(dǎo)的小鼠疲勞進行干預(yù),進一步驗證NLRP3炎癥小體作為疲勞治療靶點的價值。研究結(jié)果:1、NLRP3炎癥小體參與了LPS復(fù)合強迫游泳誘導(dǎo)的小鼠急性疲勞模型1.1成功建立小鼠急性疲勞模型,建立的方法是先在小鼠腹腔注射3 mg/Kg LPS然后進行強迫游泳20min,小鼠出現(xiàn)了明顯疲勞樣行為,表現(xiàn)為小鼠自發(fā)活動距離縮短,轉(zhuǎn)棒儀在棒時間縮短,說明模型建立成功。1.2該疲勞模型小鼠血清IL-1β和IL-6含量的升高,腦中NLRP3和Pro-IL-1β的mRNA和蛋白表達水平升高,免疫熒光結(jié)果顯示NLRP3炎癥小體組裝形成并激活。1.3與野生型小鼠相比,Nlrp3~(-/-)小鼠在LPS復(fù)合強迫游泳誘導(dǎo)下所表現(xiàn)的疲勞行為顯著減輕。Nlrp3~(-/-)小鼠在相同的LPS復(fù)合強迫游泳誘導(dǎo)下腦組織中Caspase-1酶的激活顯著減少,并伴有IL-1β水平的明顯降低。2、NLRP3炎癥小體參與了反復(fù)強迫游泳誘導(dǎo)的小鼠慢性疲勞模型2.1成功建立小鼠慢性疲勞模型,通過反復(fù)強迫游泳,負重每12 h游泳10min,連續(xù)持續(xù)14天,建立了慢性疲勞模型。反復(fù)強迫游泳可以誘導(dǎo)野生型小鼠產(chǎn)生明顯的疲勞樣行為,表現(xiàn)為小鼠自發(fā)活動距離縮短,轉(zhuǎn)棒儀在棒時間縮短,與之相比,Nlrp3~(-/-)小鼠的疲勞樣行為明顯減輕。2.2反復(fù)強迫游泳建立的慢性疲勞模型,野生型小鼠大腦前額葉皮質(zhì)腦區(qū)的NLRP3炎癥小體顯著組裝并活化,IL-1β水平顯著升高。和野生型疲勞小鼠相比,Nlrp3~(-/-)小鼠的疲勞樣行為顯著減輕,并伴有前額葉皮質(zhì)腦區(qū)和血清中IL-1β的水平顯著降低。2.3在反復(fù)強迫游泳誘導(dǎo)的疲勞下,野生型和Nlrp3~(-/-)小鼠腦中的活性氧水平,血清中丙二醛都顯著升高,但在野生型和Nlrp3~(-/-)小鼠之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。3、Ω-3不飽和脂肪酸在反復(fù)強迫游泳誘導(dǎo)的小鼠疲勞模型中的作用及其可能機制3.1Ω-3不飽和脂肪酸可以明顯改善反復(fù)強迫游泳誘導(dǎo)的小鼠疲勞樣行為,小鼠自發(fā)活動距離和轉(zhuǎn)幫儀在棒時間顯著延長。3.2Ω-3不飽和脂肪酸通過抑制反復(fù)強迫游泳誘導(dǎo)的疲勞小鼠前額葉皮質(zhì)腦區(qū)中NLRP3炎癥小體的組裝激活、IL-1β的升高以及疲勞小鼠腦中活性氧的生成來改善疲勞狀態(tài)。結(jié)論:本課題發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)NLRP3炎癥小體激活導(dǎo)致兩種不同模型的疲勞發(fā)生;NLRP3-IL-1β通路在疲勞發(fā)生過程中起重要作用。Ω-3不飽和脂肪酸通過抑制NLRP3炎癥小體的激活和活性氧的生成,進而緩解小鼠疲勞樣行為。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R363
【圖文】：

疲勞模型導(dǎo)致小鼠自發(fā)活動距離縮短，轉(zhuǎn)棒儀在棒時間縮短，表現(xiàn)出了明顯的疲勞樣行為，表示模型建立成功。因此本研究采用 LPS 復(fù)合強迫游泳的方法來建立模型，進行后續(xù)試驗。2、LPS 復(fù)合強迫游泳建立小鼠疲勞模型的炎癥因子水平和生化指標除了上述行為學(xué)實驗外，我們檢測了小鼠血清的乳酸、丙二醛（MDA），并同時檢測小鼠肌肉中 MDA 的水平，小鼠血清中炎癥因子 IL-1β、IL-6 的水平以了解小鼠的體內(nèi)的炎癥狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清中乳酸、MDA 的水平在 4 個組之間并沒有顯著性差異（圖 2.A、圖 2.B，p>0.05），肌肉中 MDA 的水平在 4 個組之間也沒有顯著性差異（圖 2.C，p>0.05）。與空白對照組相比，LPS 復(fù)合強迫游泳組小鼠血清中 IL-1β 和 IL-6 的水平顯著升高（圖 2.D、圖 2.E， p<0.01），LPS 組和強迫游泳組的炎癥因子水平則沒有顯著變化（圖 2.D、圖 2.E，p>0.05）。上述結(jié)果表明，LPS 復(fù)合強迫游泳組小鼠不僅表現(xiàn)出明顯的疲勞樣行為，并且伴有血清中 IL-1β 和 IL-6 的水平顯著升高，表明該模型伴隨有一定程度的體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

NLRP3 炎癥小體在小鼠疲勞樣行為中的作用及分子機制LPS 復(fù)合強迫游泳后，小鼠產(chǎn)生明顯的疲勞樣行為。（A）在自發(fā)活動實驗中，以 10 分鐘為間隔監(jiān)測小鼠自發(fā)活動 1 小時。與空白對照組相比，LPS 復(fù)合強迫游泳組的自發(fā)活動距離顯著減少。（B）在轉(zhuǎn)棒儀在棒時間上，相較于空白對照組，LPS 復(fù)合強迫游泳組的在棒時間也明顯縮短。結(jié)果用平均值±標準誤表示（mean ±SEM）。* p<0.05，** p <0.01 vs 空白對照組（ANOVA）。（n = 5 ~ 8）。

強迫游泳誘導(dǎo)的疲勞小鼠腦中 Caspase-1 p10 的蛋白水平也明顯升高（圖 4C，p<0.01）。上述結(jié)果表明，LPS 復(fù)合強迫游泳可以使小鼠腦中 NLRP3 蛋白表達明顯升高，Caspase-10 并且 NLRP3 炎癥小體活化的產(chǎn)物 IL-1β 也顯著提高，表明IL-1β 的升高有可能和 NLRP3 炎癥小體的激活有關(guān)。3、LPS 復(fù)合強迫游泳誘導(dǎo)的疲勞小鼠中腦中 NLRP3 炎癥小體的組裝和激活情況同時為了更加直觀地反映 NLRP3 炎癥小體的組裝狀態(tài)，本研究應(yīng)用了免疫熒光染色的方法，將細胞核標記為藍色，NLRP3 蛋白標記為綠色，IL-1β 標記為紅色，當 NLRP3 和 IL-1β 相互聚集時，會合成顯色為黃色，表示 NLRP3 炎癥小體處在組裝狀態(tài)，表示 NLRP3 炎癥小體激活。結(jié)果表明 LPS 復(fù)合強迫游泳誘導(dǎo)的疲勞小鼠的腦區(qū)切片中的黃色區(qū)域明顯增多，提示 NLRP3 炎癥小體處于激活狀態(tài)（圖 4D）。以上結(jié)果表明 NLRP3 炎癥小體和 LPS 復(fù)合強迫游泳誘導(dǎo)的疲勞小鼠導(dǎo)致的疲勞行為密切相關(guān)，因此，接下來用 Nlrp3-/-小鼠來驗證基因敲除以后，小鼠的疲勞行為是否有改善。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Shu-Long Wang;Ge Zhao;Wei Zhu;Xiao-Meng Dong;Ting Liu;Yuan-Yuan Li;Wen-Gang Song;Yi-Qiang Wang;;Herpes simplex virus-1 infection or Simian virus 40-mediated immortalization of corneal cells causes permanent translocation of NLRP3 to the nuclei[J];International Journal of Ophthalmology;2015年01期

本文編號：2762506