【摘要】：老年癡呆癥、帕金森、癲癇和抑郁癥等病癥是長期危及患者健康且難以治愈的腦功能疾病。探索腦功能疾病的發(fā)病機制和發(fā)明有效的診療方法是領域內(nèi)的緊迫需要。神經(jīng)調控技術是開展神經(jīng)科學研究與探索腦功能疾病診療方法的基本手段。當今主流的大腦神經(jīng)調控方法包括化學藥劑法、深腦電刺激法(DBS)、經(jīng)顱直流電刺激法(tDCS)、經(jīng)顱磁刺激法(TMS)和光感基因法。這些方法各具優(yōu)缺點,卻仍沒有方法可以同時實現(xiàn)無創(chuàng)和全腦精確定位等功能。例如化學藥劑法簡單易用,但其作用靶向性差、藥副作用大,且容易出現(xiàn)藥耐受。DBS雖然空間分辨力高,但屬于有創(chuàng)方法。tDCS和TMS雖然均屬無創(chuàng)方法,但均具有穿透深度淺、空間分辨力低的不足。光感基因法雖然具有極高空間分辨力,但需依托基因操控,難以實現(xiàn)臨床轉化。因此,同時具備無創(chuàng)、高時空分辨力以及可全腦大范圍定位等優(yōu)點的神經(jīng)調控方法是臨床腦功能疾病治療的研究熱點。超聲波屬于機械波,無電離輻射,可無創(chuàng)穿透軟組織甚至顱骨,可對靶點組織實施機械振動、熱、空化或輻射力等多種聲學物理作用。近年來,已經(jīng)有學者利用超聲波對外周神經(jīng)甚至大腦實施刺激研究,并證實低強度經(jīng)顱聚焦超聲波具有神經(jīng)調控功能,有望滿足無創(chuàng)、高時空分辨力以及可全腦大范圍定位的神經(jīng)調控需求。目前,領域內(nèi)已采用熒光成像、電生理、微透析、功能磁共振成像、葡萄糖代謝成像和行為響應測量等多種評估方法,對各種實驗對象,包括神經(jīng)元、離體神經(jīng)干、離體腦片、小鼠、大鼠、迷你豬、兔子、羊、猴子和人,開展多項神經(jīng)調控研究。上述實驗結果已經(jīng)證明了超聲神經(jīng)調控技術的有效性,但超聲神經(jīng)調控的作用機制仍未明晰;神經(jīng)調控的參數(shù)和實驗范式尚未成熟;針對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方案尚不完善。為了推動超聲神經(jīng)調控技術由科學假設演變成臨床應用,針對實驗動物的超聲神經(jīng)調控實驗研究還應被廣泛開展。通過在科學網(wǎng)統(tǒng)計近十年來神經(jīng)科學領域以實驗動物作為研究對象的科研論文成果發(fā)現(xiàn),選擇大鼠和小鼠做為實驗對象的論文的比例分別是49%和37%。由此可見,嚙齒動物是神經(jīng)科學研究的主要動物類型,早期的超聲神經(jīng)調控研究也應主要基于嚙齒動物開展,尤其是小鼠。因為小鼠具有疾病模型種類齊全(例如基因改造小鼠)、基礎研究資源豐富、行為學研究便捷和便于飼養(yǎng)等優(yōu)點。然而,當前基于小鼠的超聲神經(jīng)調控實驗存在兩大技術瓶頸。其一,常規(guī)超聲神經(jīng)調控實驗所用的超聲探頭體積太大,導致實驗小鼠須被麻醉并固定頭部,從而嚴重影響了正常神經(jīng)調控結果的評估,也限制了涉及認知和行為學實驗的開展;其二,低頻超聲的作用靶點過大(例如0.5 MHz超聲,-3 dB靶點直徑可達8mm),而小鼠大腦的尺寸較小(寬約10mm),因此采用常用的低頻超聲難以準確對特定大腦核團開展刺激研究,更難以對神經(jīng)網(wǎng)絡開展多點調控研究。針對上述瓶頸問題,本課題確立了如下三個研究目標:目標一:設計并加工微型頭戴式超聲刺激裝置,用于對清醒的、可自由活動的小鼠實施超聲神經(jīng)刺激,并針對運動行為學開展無創(chuàng)調控研究。為探索超聲刺激對神經(jīng)系統(tǒng)的作用機制以及對動物行為的調控作用,提供新方法、新工具。目標二:減少超聲聲學作用的焦點尺寸,提高空間分辨力,探討高頻超聲(5MHz)刺激小鼠大腦的可行性,并建立不同腦區(qū)對神經(jīng)調控的反應關系。實現(xiàn)更精準的神經(jīng)調控,為研究超聲頻率對神經(jīng)調控的影響提供數(shù)據(jù)。目標三:設計并加工新型陣列超聲刺激系統(tǒng),實現(xiàn)靶點可視化定位及雙靶點神經(jīng)刺激。為研究神經(jīng)調控的網(wǎng)絡調控功能提供工具,為設計新一代的刺激、評估一體的神經(jīng)調控系統(tǒng)提供思路。結合上述研究目標,本文分別闡述了如下三方面的研究工作及意義:研究一:設計并加工了微型頭戴式超聲刺激裝置,驗證了對自由活動的清醒小鼠實施神經(jīng)調控的功能,實現(xiàn)了超聲作用下的原位腦電采集,并開展了針對行為學的調控研究。該裝置的核心部分為超聲刺激器,主要部件包括小型的壓電陶瓷片、凹形環(huán)氧聲透鏡、外殼和插座部件。應用該刺激裝置刺激小鼠的初級體感皮層的桶狀區(qū)域可誘發(fā)原位記錄的動作電位,并且可以引起小鼠的轉頭行為。實驗結果表明,頭戴式刺激器神經(jīng)調控的方法可實現(xiàn)基于自由活動小鼠的無創(chuàng)超聲神經(jīng)調控,該方法解除了常規(guī)超聲系統(tǒng)對實驗動物的肢體限制和麻醉藥劑對神經(jīng)調控結果的干擾,為基于清醒可自由活動動物的超聲神經(jīng)調控研究提供新的方法和工具。研究二:分別用1MHz和5MHz超聲對同一組小鼠實施超聲腦刺激,并通過定量比較尾部肌電信號和分析肢體動作視頻的方法評估刺激效果。結果表明,5 MHz超聲可成功實現(xiàn)神經(jīng)刺激,5 MHz超聲刺激的等效直徑(0.29±0.08 mm)明顯小于1 MHz超聲(0.83±0.08 mm);5 MHz超聲刺激的潛伏期(45±31 ms)也小于1 MHz超聲(208±111 ms)�？梢�,高頻超聲(5 MHz)極有可能用較小的刺激靶點成功激活小鼠的某些神經(jīng)環(huán)路,并改善神經(jīng)刺激的解剖特異性。該結果為改善超聲神經(jīng)調控空間分辨力提供思路,為設計超聲神經(jīng)調控參數(shù)補充參考數(shù)據(jù),為發(fā)現(xiàn)和研究小尺度超聲敏感的大腦核團提供方法和工具。研究三:結合“研究二”的實驗結果,設計并搭建了可實現(xiàn)成像引導的雙靶點超聲神經(jīng)調控新系統(tǒng)。該系統(tǒng)可通過對5 MHz陣列超聲探頭進行雙焦點的切換控制實現(xiàn)對小鼠雙靶點交替腦刺激,靶點的位置可由同一探頭所形成的B超成像預先定位。刺激效果通過肌電信號和動作視頻評估。該研究可為基于超聲成像引導的多靶點神經(jīng)調控研究提供方法和工具。總之,本研究為解決針對小動物的超聲神經(jīng)調控研究所遇到的瓶頸問題,展開了聲學和電學的相關理論分析,研制了頭戴式超聲神經(jīng)調控裝置和成像引導的雙靶點超聲刺激系統(tǒng)樣機,并基于搭建的裝置和系統(tǒng)開展了小鼠神經(jīng)調控研究。該研究結果不僅為探索超聲神經(jīng)調控機制提供了參考數(shù)據(jù),而且為拓展超聲神經(jīng)調控實驗研究提供新的方法和工具。
【學位授予單位】：中國科學院大學(中國科學院深圳先進技術研究院)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R-33;R741
【圖文】：

中國科學院大學博士學位論文──小動物無創(chuàng)超聲腦神經(jīng)調控方法研究經(jīng)顱電刺激和經(jīng)顱超聲刺激等非侵入式方法，以及電極深部腦刺激、光感基因和紅外神經(jīng)刺激等侵入式方法（Naor，2016）。1.1.2 常用的神經(jīng)調控方法繼 1870 年德國科學家報道了電刺激犬的大腦皮層可引發(fā)特定的軀體反應之后的 100 多年里，電、磁、光等技術與神經(jīng)科學相結合產(chǎn)生了電極深部腦刺激、經(jīng)顱磁刺激、光基因調控等神經(jīng)刺激與調控技術（Lewis，2016）（如圖 1.1 所示）。

中國科學院大學博士學位論文──小動物無創(chuàng)超聲腦神經(jīng)調控方法研究振動頻率的不同，超聲波可不同程度地無創(chuàng)穿透顱骨。頻率越低，穿透顱骨的效率越高。實驗研究表明（Clement，2002），頻率小于 650kHz 的超聲波具有較好的人體顱骨穿透效果，有望實現(xiàn)無創(chuàng)神經(jīng)調控的功能。

1.2 低頻低強度超聲刺激離體小鼠全腦誘發(fā)腦細胞內(nèi)鈣升高離體小鼠全腦的實驗裝置，超聲從顱腦底部入射，并用共聚焦顯微鈣瞬變結果；（b）超聲刺激誘發(fā)顱腦背側體細胞的鈣瞬變曲線，，綠線為平均值；（c）共聚焦顯微鏡對顱腦背側表面細胞的鈣成圖為超聲刺激 2 秒后圖像。（Tyler, 2008） 1.2 Calcium increase in the brain cells induced by low frequency aintensity ulrasonic stimulation. （Tyler, 2008）聚焦技術，如凹型輻射面聚焦（如圖 1.3）、聲學透鏡聚等技術，超聲波的傳播路徑和聚焦效果可被精確控制，從較高的空間分辨力和靈活的靶點位置調控能力。超聲波頻焦的空間分辨力也會越高。

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