【摘要】：近年來隨著微生物學研究的深入開展,越來越多的新發(fā)致病性微生物與臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展緊密相關。病毒作為微生物的一種,它也會對動物以及人類的健康構(gòu)成威脅。隨著社會發(fā)展,人類的活動日益頻繁,經(jīng)貿(mào)往來、跨國旅游、城市化進程以及森林砍伐等不斷加劇導致了病毒性的疾病爆發(fā)的風險持續(xù)增加。同樣,新型病毒感染導致的疾病也越來越多。報道顯示,有些病毒可以在動物體內(nèi)長期潛伏存在而不會導致動物明顯的臨床癥狀,但如果病毒發(fā)生跨種間動物傳染至人則會產(chǎn)生較為嚴重的臨床癥狀,比如人類免疫缺陷病毒(HIV)、SARS病毒、MERS病毒等。因此,解析動物以及人體內(nèi)特定微環(huán)境病毒的構(gòu)成、比較兩者之間病毒組成的差異,并挖掘其中潛在具有致病性的新型病毒具有重要的公共衛(wèi)生學意義。目前傳統(tǒng)的病毒分析方法如細胞培養(yǎng)、電鏡觀察、PCR、ELISA等方法對于新型病毒的發(fā)現(xiàn)和檢測具有較大的局限性。隨著下一代測序技術的出現(xiàn)和生物信息學的發(fā)展,病毒宏基因組學(Viral metagenomics)應運而生。病毒宏基因組學是以特定環(huán)境中全部病毒基因的總和─包括全部真核生物病毒和原核生物病毒(噬菌體)核酸為研究對象,以不依賴于有機體培養(yǎng)的技術手段,對該環(huán)境樣品中病毒多樣性、種群結(jié)構(gòu)、互作關系進行全面研究的新型病毒學研究方法。該方法突破了傳統(tǒng)方法對于病毒研究的限制,可以有效地用于特定樣品病毒群落解析。為了探究和比較奶牛與人生殖道微環(huán)境內(nèi)病毒群落構(gòu)成,并挖掘生殖道微環(huán)境內(nèi)新型病毒,本研究采用病毒宏基因組學的方法對奶牛與人的生殖道拭子樣本構(gòu)建病毒宏基因組文庫,采用Illumina Miseq測序平臺進行測序,深入分析文庫內(nèi)病毒基因序列并形成病毒群落結(jié)構(gòu)。本課題研究的主要內(nèi)容包括:(一)奶牛生殖道病毒組研究對采集的80份健康奶牛生殖道拭子樣品病毒群落解析,結(jié)果顯示奶牛生殖道病毒群落在科水平上包括:雙鏈DNA(ds DNA)病毒:腺病毒科(Adenoviridae)0.0797%、囊泡病毒科(Ascoviridae)0.5503%、桿狀病毒科(Baculoviridae)0.3068%、皰疹病毒科(Herpesviridae)5.7212%(其中包含異皰疹病毒科Alloherpesviridae0.0746%)、乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae)1.1159%、多瘤病毒科(Polyomaviridae)0.1029%、痘病毒科(Poxviridae)38.4279%。雙小RNA病毒科(Picobirnaviridae)0.0771%。反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)0.7688%。單鏈DNA(ss DNA)病毒:圓環(huán)病毒科(Circoviridae)8.6781%、Genomoviridae病毒科7.035%、細小病毒科(Parvoviridae)0.2237%、小環(huán)狀DNA病毒科(Smacoviridae)8.3027%、分類不明的單鏈DNA病毒(Unclassified ss DNA Virius)27.1657%。ss RNA病毒:星狀病毒科(Astroviridae)0.0180%、冠狀病毒科(Coronaviridae)1.2162%、小RNA病毒科(Picornaviridae)0.0103%。未分類的RNA病毒(Unclassified RNA Virius)0.198%。奶牛生殖道病毒群落的組成特點:(1)病毒群落組成多樣性高。(2)其中哺乳動物病毒序列占比高達65.2945%。(3)包含1株新型乳頭瘤病毒(Papillomavirus)。(4)包含2種牛多瘤病毒bovine polyomaviruses。(5)包含6株新型CRESS-DNA病毒。(二)人生殖道病毒組研究對采集的100份人陰道拭子病毒群落進行解析,結(jié)果顯示人陰道病毒群落在科水平上的構(gòu)成是:雙鏈DNA(ds DNA)病毒:囊泡病毒科0.1173%、桿狀病毒科0.2346%、皰疹病毒科0.2346%、乳頭瘤病毒科51.1928%、痘病毒科2.3465%。反轉(zhuǎn)錄病毒科15.4869%。肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)0.0782%。單鏈DNA(ss DNA)病毒:指環(huán)病毒科(Anelloviridae)29.2912%、細小病毒科0.0391%。單鏈RNA(ss RNA病毒):星狀病毒科0.0391%、小RNA病毒科0.8604%和一些分類不明的單鏈DNA病毒(Unclassified ss DNA Virius)0.0391%。未分類的RNA病毒0.0391%。人陰道病毒群落的組成特點:(1)病毒序列豐度高。(2)其中哺乳病毒序列占比達99.6872%。(3)包含1株新的人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)。(4)包含3株新型指環(huán)病毒(Anellovirius)序列。(三)奶牛與人生殖道病毒群落的比較奶牛與人生殖道病毒群落在構(gòu)成上具有相同點亦有差異之處,主要表現(xiàn)在,奶牛生殖道病毒群落多樣性大于人生殖道病毒群落。人生殖道內(nèi)存在指環(huán)病毒,而奶牛生殖道不含此類病毒。(四)新型病毒的發(fā)現(xiàn)及其系統(tǒng)進化分析(1)新型乳頭瘤病毒在奶牛生殖道拭子Cattle S02號文庫以及人生殖道拭子LVS02號文庫中分別發(fā)現(xiàn)一株新型乳頭瘤病毒。乳頭瘤病毒科家族具有高度多樣性,該病毒是雙鏈環(huán)狀DNA病毒,大小約為8kb,具有高度保守的開放閱讀框(ORF)L1區(qū)。在奶牛生殖道Cattle S02號文庫中發(fā)現(xiàn)的新型乳頭瘤病毒命名為bovine papillomavirus ujs-21015,全長7398bp,包含早期基因E6(1-426bp)、E7(428-751bp)、E1(738-2564bp)、E2(2506-3747bp)和晚期基因L1(5376-6887)、L2(3828-5369bp)以及長鏈非編碼區(qū)LCR(6888-7389),基于L1蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,該毒株屬于Dyoxipapillomavirus病毒屬內(nèi)的新種(species)。在人生殖道LVS02號文庫中發(fā)現(xiàn)的新型乳頭瘤病毒命名為new HPV全長7354bp,包含早期基因E7(195-494)、E1(475-2379)、E2(2321-3487)和晚期基因L2(3551-5164)和L1(5085-6710),同樣基于L1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該毒株是Gammapapillomavirus病毒屬內(nèi)的新種(species)。(2)新型CRESS-DNA病毒CRESS-DNA病毒是能夠編碼蛋白的一類環(huán)形的單鏈DNA病毒,它主要編碼的蛋白有Rep蛋白和Cap蛋白。CRESS-DNA這一類病毒包含有Circoviridae、Geminiviridae、Nanoviridae等。本研究在奶牛生殖道病毒組文庫中發(fā)現(xiàn)6株新型CRESS-DNA病毒,分別命名為C0101(2,255 bp)、C05001(2,562 bp)、C042793(2,958bp)、C021765(2,727 bp)、C025899(2,734bp)、C013782(3,085bp),其中C0101、C05001和C042793與圓環(huán)病毒科(Circoviridae)中的部分病毒相似,C021765和C025899與環(huán)狀病毒相似,C013782與Genomoviridae中的gemycircularvirus相似。(3)多瘤病毒在奶牛生殖道拭子Cattle S05號文庫中發(fā)現(xiàn)多瘤病毒基因序列,經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)文庫中含有兩株不同的多瘤病毒毒株,分別與多瘤病毒BPy V1(KM496323)和BPy V2(KX455486)具有較近的親緣關系。多瘤病毒在哺乳動物和鳥類中分布廣泛,大部分哺乳動物的多瘤病毒可以導致有免疫力的宿主存在持續(xù)性的無癥狀感染,部分多瘤病毒經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)可以致病免疫力低下的宿主。本次研究在奶牛生殖道發(fā)現(xiàn)的多瘤病毒BPy V1和BPy V2之前在牛肉中也被發(fā)現(xiàn)過,目前對于該病毒在宿主中是否存在于其它部位尚不清楚,本次在奶牛生殖道中發(fā)現(xiàn)這兩株病毒可能對于該病毒的傳播方式有一定的提示意義。(4)新型指環(huán)病毒人生殖道病毒群落內(nèi)含有高豐度的指環(huán)病毒序列,經(jīng)過生物信息學分析后得到3株指環(huán)病毒基因組中的最大開放閱讀框(ORF1),3株指環(huán)病毒序列分別命名為ujs0601、ujs0801、ujs0804,經(jīng)過比對后確認該3株均為新型指環(huán)病毒序列。指環(huán)病毒為單鏈環(huán)狀DNA病毒,主要包括3個編碼區(qū),目前研究認為ORF1所編碼的蛋白在基因組復制的過程中起作用。指環(huán)病毒是廣泛存在于人的體液當中。該病毒與疾病的關聯(lián)性還不是十分清楚,有待于將來基于特定疾病的流行病學研究來闡明其與生殖道相關疾病的關聯(lián)性。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R373;S852.65
【圖文】：

圖 1.1 病毒宏基因組學研究路線Fig.1.1 The research route of viral metagenomics學已經(jīng)成為從臨床樣本中發(fā)現(xiàn)新病毒的最有力工用病毒宏基因組學方法。作為一種無偏差（unb毒宏基因組學的方法容易受到低病毒-宿主e ratios）等因素的影響[28, 29]。在有些樣品中病毒樣品中存在的細菌和真核生物的核酸，這些因素此，富集病原體的遺傳物質(zhì)和消除宿主本身遺傳如今有一系列的病毒富集方法包括物理方法和酶如通過反復凍融裂解細胞釋放病毒粒子，通過不 μm）和離心，酶消化宿主基因組等[30-33]。

2.2 病毒宏基因組文庫質(zhì)量控制及結(jié)果分析2.2.1 病毒宏基因組文庫質(zhì)量控制我們利用 1%瓊脂糖凝膠電泳來觀察文庫篩選前后的 DNA 片段分布情況。如圖2.1 所示：A 圖當中 1-5 代表的是奶牛生殖道拭子病毒宏基因組文庫 CattleS01-CattleS05，6-15 代表的是人生殖道拭子病毒宏基因組文庫 LVS01- LVS10。B 圖是文庫混合后經(jīng)過篩選純化后的電泳結(jié)果。

圖 2.3 奶牛生殖道病毒組構(gòu)成-科水平Fig.2.3 The virome composition of bovine genital tract- Family屬水平上：鏈 DNA（dsDNA）病毒：腺病毒科中含有 Aviadenovirus、Mastadeno科中含有 Ascovirus、Toursvirus；桿狀病毒科中含有 Alphabacuculovirus ； 皰 疹 病 毒 科 中 含 有 Cyprinivirus 和 Alloherpesverpesvirinae、Gammaherpesvirinae 三個亞科，其中 Gammaherpesvirinaacavirus 和 Rhadinovirus；乳頭瘤病毒科中含有 Dyokappapillomavirus 以乳頭瘤病毒科；分類不明的多瘤病毒科；痘病毒科中含有 Chordopoxvpoxvirinae 兩個亞科，除了這兩個亞科中分類不明的，其中 Chordop有 Avipoxvirus、Orthopoxvirus、Parapoxvirus，Entomopoxvirinae 亞科ntomopoxvirus、Betaentomopoxvirus。 RNA 小病毒科中含有 Picobirnavirus。

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本文編號：2756483