【摘要】：目的:衰老和糖尿病常伴隨氧化應(yīng)激的增加,通常與心血管疾病有關(guān)。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)數(shù)量減少和功能降低在內(nèi)皮修復(fù)和心血管疾病發(fā)展中起關(guān)鍵作用。Nrf2調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài),在氧化應(yīng)激中起重要保護(hù)作用。本研究的目的是探討Nrf2對糖尿病及衰老進(jìn)程中EPCs功能障礙的作用及潛在機(jī)制。方法:(1)通過飼養(yǎng)建立自然衰老小鼠模型。檢測年輕(3~4個月),中年(12~13個月)和老年小鼠(22~24個月)EPCs的生物學(xué)功能。體外實驗包括檢測EPCs的遷移,增殖,成管和分泌(VEGF,SDF-1)功能。在體手術(shù)制備小鼠下肢缺血模型,使用激光多普勒灌注檢測術(shù)后血流灌注恢復(fù)情況。測量缺血性腓腸肌中毛細(xì)血管密度。通過檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS),超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)評估前述EPCs中的氧化應(yīng)激水平。此外,通過si RNA進(jìn)行沉默年輕組小鼠EPCs中Nrf2表達(dá)和使用t BHQ活化老年組小鼠EPCs中Nrf2后再次評估EPCs的功能和氧化應(yīng)激水平。Western Blot用于檢測Nrf2,keap1,NLRP3,TRX1,TXNIP,p65的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。RT-PCR用于測定Nrf2,HO-1,NOQ-1,TRX-1,keap1,NLRP3,TXNIP,p65的m RNA表達(dá)。使用免疫熒光檢測細(xì)胞及腓腸肌中Nrf2表達(dá)。(2)使用鏈球菌素造糖尿病小鼠模型。檢測糖尿病小鼠中EPCs的生物學(xué)功能,包括遷移,增殖,成管和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),基質(zhì)衍生生長因子(SDF)和一氧化氮(NO)的分泌功能。檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS),超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)以評估糖尿病小鼠EPCs的氧化應(yīng)激水平。檢測p16,β-gal和SASP來評估EPCs的衰老。此外,使用si RNA技術(shù)沉默正常組Nrf2表達(dá)或通過t BHQ活化糖尿病小鼠Nrf2后評估EPCs的功能和氧化應(yīng)激水平。結(jié)果:(1)體外和體內(nèi)EPCs的生物學(xué)功能在衰老過程中降低,伴隨著Nrf2表達(dá)及其靶基因(HO-1,NQO-1,TRX-1)的下降以及通過增加ROS增加的NLRP3表達(dá)和氧化應(yīng)激水平。和MDA含量和降低SOD活性。此外,Nrf2沉默明顯損害了EPCs的生物學(xué)功能,并增強(qiáng)了幼鼠EPCs的氧化應(yīng)激。而Nrf2激活通過下調(diào)NLRP3炎性體來保護(hù)老年小鼠的受損EPCs免受氧化應(yīng)激,并改善來自老年小鼠的EPCs的生物功能障礙。(2)糖尿病EPCs的生物學(xué)功能下降,伴隨著Nrf2表達(dá)下降,細(xì)胞衰老加速,氧化應(yīng)激水平升高,ROS和MDA含量增加,SOD活性降低。此外,Nrf2沉默明顯損害了正常EPCs的遷移,增殖和分泌,增強(qiáng)了氧化應(yīng)激和細(xì)胞衰老,而Nrf2激活保護(hù)了糖尿病EPCs免受氧化應(yīng)激和細(xì)胞衰老,改善了糖尿病小鼠EPCs的生物學(xué)功能障礙。結(jié)論:老年和糖尿病小鼠EPCs生物學(xué)功能下降,氧化應(yīng)激水平較對照組增加。Nrf2可改善氧化應(yīng)激水平進(jìn)一步保護(hù)老年和糖尿病小鼠EPCs生物學(xué)功能。Nrf2通過NF-κB信號通路下調(diào)NLRP3炎癥小體,可以保護(hù)衰老進(jìn)程中EPCs的功能損害。Nrf2通過調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老來保護(hù)糖尿病小鼠中EPCs的功能性損傷。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R587.1;R592;R-332
【圖文】：

26圖 2 EPCs 中 Nrf2 表達(dá)隨著年齡的增長而減少。（A）低放大倍數(shù)圖像顯示 Nrf2 不同年齡組 EPCs 上的表達(dá)。（B）為 A 圖的統(tǒng)計結(jié)果。（C）高放大倍數(shù)共聚焦圖像示 Nrf2 在不同年齡組 EPCs 上的表達(dá)[細(xì)胞質(zhì)中的 Nrf2 表達(dá)（白色箭頭）和/或較輕細(xì)胞中的細(xì)胞核（紅色箭頭），MA 和 O 細(xì)胞中的 Nrf2 表達(dá)低或無（黃色箭頭）]。P <0.05。N = 5。 Y，年輕組; M，中年組; A，老年組。 比例尺：A，100μm; C20μm。

當(dāng)老年 EPCs 中 Nrf2 上調(diào)時（圖 4G），它們的遷移（圖 4H 和 I），增殖（圖4J）和血管生成（圖 4K）分泌（圖 4L）顯著改進(jìn)，使它們類似于 年輕 細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，改變內(nèi)在的 Nrf2 表達(dá)足以顯著改變 EPCs 的存活和功能，支持該轉(zhuǎn)錄因子在衰老過程中對 EPCs 功能的重要調(diào)節(jié)作用。這些數(shù)據(jù)證實了通過調(diào)節(jié)來源于年輕和年老EPCs的Nrf2的表達(dá)可以改變其生物學(xué)功能，證實了 Nrf2 對 EPCs 生物學(xué)功能的重要

Transwell實驗圖示

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本文編號：2755603