【摘要】：第一部分呼吸道合胞病毒預(yù)防性肽疫苗的設(shè)計目的:嘗試運用理論設(shè)計和分子模擬技術(shù)確定和優(yōu)化呼吸道合胞病毒的肽疫苗。方法:首先檢索蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中呼吸道合胞病毒相關(guān)蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)和呼吸道合胞病毒中和抗體-識別肽段的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。后采用分子模擬,分析了中和抗體與表位肽間作用方式;通過分子動力學(xué)模擬技術(shù)評估FFL-001抗原蛋白的各個部分對其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用及與中和抗體結(jié)合的影響;通過理性設(shè)計優(yōu)化得到抗原肽,并評估其與中和抗體的作用,最終通過實驗來驗證其效果。結(jié)果:1.成功從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中獲取RSV F蛋白變構(gòu)前后高級結(jié)構(gòu)晶體數(shù)據(jù),抗體Motavizumab與其表位肽的共晶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。2.對F蛋白變構(gòu)前后的高級結(jié)構(gòu)分析可知,F蛋白的結(jié)構(gòu)中存在高級結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定的肽段,該肽段受F蛋白變構(gòu)影響較小。該肽段亦是已開發(fā)的RSV中和抗體的靶標(biāo)。3.結(jié)構(gòu)和能量分析Motavizumab-FFL_001作用表明,FFL-001與抗體Motavizumab的結(jié)合區(qū)僅局限于H2和H3螺旋連接轉(zhuǎn)角區(qū)(氨基酸65-89),在此相互作用界面上,存在9個氫鍵和一條鹽橋作用。4.分子動力學(xué)結(jié)果表明,完整FFL-001能在整個動力學(xué)模擬時段內(nèi)能維持穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu),而缺少H1螺旋束的FFL_001的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變構(gòu);H2和H3螺旋連接轉(zhuǎn)角區(qū)(即Motavizumab結(jié)合位點肽段(氨基酸65-89))肽段結(jié)構(gòu)只有其N端的一小段螺旋結(jié)構(gòu)維持著,而其C-端和中間的氨基酸序列呈完全的無序狀態(tài)。5.能量評估顯示,全長的FFL-001產(chǎn)生的結(jié)合能ΔGtotal為-23.6kcal/mol;其中可分解為FFL-001與Motavizumab有益作用能ΔGint=-110.8kcal/mol,和不益的去溶劑化作用ΔGslv=71.5kcal/mol以及一部分較弱的熵懲罰作用-TΔS=15.7kcal/mol;雙螺旋束H2-H3和Motavizumab結(jié)合位點肽段與完整的FFL-001相比呈現(xiàn)出完全不同能量變化;在與Motavizumab結(jié)合時,這兩個肽段出現(xiàn)了較大的熵懲罰(-TΔS分別為47.2和27kcal/mol)和不利的去溶劑化作用(ΔGslv分別為52.6和58.8kcal/mol)。雙螺旋束H2-H3的ΔGtotal為3.4kcal/mol,Motavizumab結(jié)合位點肽段的ΔGtotal為 7.9kcal/mol。6.對Motavizumab結(jié)合位點肽段進(jìn)行截斷和環(huán)化處理,能量評估顯示不同的環(huán)化位點對于環(huán)肽與Motavizumab的結(jié)合產(chǎn)生較大影響;其中與Motavizumab結(jié)合表現(xiàn)最好的環(huán)化肽,命名為環(huán)化PV2;它與Motavizumab的親和能ΔGtotal值達(dá)-21.2kcal/mol。實驗結(jié)果亦顯示,經(jīng)人工合成環(huán)肽PV2與Motavizumab亦具有較強(qiáng)的親和力(Kd為16.2n M)。結(jié)論:1.FFL-001中與Motavizumab直接作用的肽段(氨基酸65-89)與F蛋白中空間結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定的肽段的序列相一致。2.不同長度截斷得到的含與Motavizumab直接作用部位的肽段經(jīng)環(huán)化后的環(huán)肽與抗體Motavizumab親和力存在明顯的差異。環(huán)肽PV2與Motavizumab親和力最好,與FFL-001相當(dāng)。3.實驗驗證環(huán)化PV2確實能與抗體Motavizumab產(chǎn)生較強(qiáng)的作用。第二部分呼吸道合胞病毒F蛋白基因克隆及原核表達(dá)目的:得到全長RSV F蛋白,用于免疫小鼠和后續(xù)免疫效果評估。方法:首先通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞擴(kuò)增RSV病毒,提取病毒的基因后,通過反轉(zhuǎn)錄PCR及PCR技術(shù)克隆RSV F蛋白的基因,后將克隆到RSV的F蛋白基因克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒p ET-28a多克隆位點中;得到重組質(zhì)粒p ET-28a-F導(dǎo)入大腸桿菌BL21中,并通過異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)。最后通過Ni2+親和層析純化重組的F蛋白。結(jié)果:1.病毒基因組經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到的c DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增,成功克隆得到RSV的F蛋白基因。瓊酯糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示,其序列總長約為1700bp,與預(yù)期相一致。后經(jīng)測序鑒定序列正確。2.在一定濃度IPTG的誘導(dǎo)下,重組大腸桿菌成功地表達(dá)目的蛋白,經(jīng)SDS-PAGE檢測,目的蛋白大小約為70k D左右,與理論值相符。3.重組F蛋白經(jīng)大腸桿菌大量表達(dá)后,經(jīng)Ni2+親和層析純化后,得到純度非常高的重組F蛋白。結(jié)論:1.通過分子克隆技術(shù)成功克隆得到RSV病毒的F蛋白基因。并能夠成功地在原核生物中進(jìn)行表達(dá)。2.經(jīng)純化得到重組F蛋白純度較高,可用于后續(xù)實驗。第三部分環(huán)化PV2與線性PV2蛋白免疫效果的研究目的:檢測環(huán)化新型RSV抗原表位PV2在小鼠中的肌肉注射免疫效果和鼻黏膜免疫效果,并與非環(huán)化新型RSV抗原表位PV2的免疫效果進(jìn)行比較。方法:1.培養(yǎng)并純化足夠量的RSV病毒,并測定得到的RSV的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(50%tissue culture infective dose,TCID50)。2.選取45只6~8周齡的雌性Balb/c小鼠,將其隨機(jī)分為9組(5只/組):磷酸鹽緩沖液(PBS)組;弗氏佐劑組;明膠佐劑組;PV2/明膠/滴鼻組;PV2/弗氏佐劑組/肌肉注射;環(huán)化PV2/明膠/滴鼻組;環(huán)化PV2/弗氏佐劑組/肌肉注射;F蛋白/明膠/滴鼻組;F蛋白/弗氏佐劑組/肌肉注射。3.首次免疫后2周進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫,二次免疫后2周進(jìn)行第三次加強(qiáng)免疫。首次和第二次免疫后第14天斷尾取血,最后一次免疫后第10天,眼眶采血并處死小鼠。4.使用間接ELISA法檢測肌肉注射和鼻免疫小鼠血清特異性Ig G抗體效價。5.采集小鼠肺、鼻灌洗液,使用間接ELISA法檢測免疫小鼠肺、鼻灌洗液的特異性Ig G滴度。6.在Vero細(xì)胞模型中檢測免疫小鼠血清中和抗體能力,采用微量中和試驗檢測免疫小鼠血清中和抗體滴度。同時通過間接免疫熒光檢測小鼠抗血清對于病毒天然F蛋白的識別作用。結(jié)果:1.我們使用Vero細(xì)胞培養(yǎng)RSV病毒,培養(yǎng)7天后收獲病毒上清,使用Karber法測定病毒的TCID50,結(jié)果顯示病毒效價為10-8.5。2.間接ELISA法檢測免疫小鼠血清特異性Ig G抗體效價結(jié)果顯示:1)肌注的免疫效果優(yōu)于滴鼻。其中,PV2/明膠佐劑/滴鼻組免疫三次后小鼠血清特異性Ig G抗體效價為1:40,PV2/弗氏佐劑/肌肉注射免疫三次后小鼠血清特異性Ig G抗體效價為1:158;環(huán)化PV2/明膠佐劑/滴鼻組免疫三次后小鼠血清特異性Ig G抗體效價為1:630,環(huán)化PV2/弗氏佐劑/肌肉注射免疫三次后小鼠血清特異性Ig G抗體效價為1:1584;F蛋白/明膠佐劑/滴鼻組免疫三次后小鼠血清特異性Ig G抗體效價為1:19952,F蛋白/弗氏佐劑/肌肉注射組免疫三次后小鼠血清特異性Ig G抗體效價為1:50118。2)環(huán)化的PV2誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性Ig G抗體的能力明顯優(yōu)于非環(huán)化PV2。其中,PV2肽組:一免后沒有特異性Ig G產(chǎn)生。二免后,有低水平的特異性Ig G抗體產(chǎn)生。在第三次免疫后,有一定水平的特異性Ig G抗體產(chǎn)生。環(huán)化PV2肽組:首次免疫后即可檢測到特異性Ig G抗體,且每次免疫后的抗體的滴度都遠(yuǎn)高于PV2肽組,其初次免疫后的血清效價滴度甚至優(yōu)于全長F蛋白的免疫效果。3.間接ELISA法測免疫小鼠肺灌洗液、鼻灌洗液特異性Ig G抗體效價結(jié)果顯示:1)三種抗原蛋白通過肌注免疫使得小鼠肺中產(chǎn)生不同水平的特異性Ig G抗體,而在小鼠的鼻腔中,抗原環(huán)化PV2和F蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生一定水平的抗體。而通過滴鼻免疫方式免疫的小鼠肺灌洗液、鼻灌洗液中均未檢測到特異性Ig G抗體產(chǎn)生。2)PV2/弗氏佐劑/肌肉注射組肺灌洗液中特異性Ig G抗體效價為1:12。環(huán)化PV2/弗氏佐劑/肌肉注射組肺灌洗液中特異性Ig G抗體效價為1:132;鼻灌洗液中特異性Ig G抗體效為1:5。重組F蛋白肌肉注射免疫小鼠中,肺灌洗液中的抗體效價達(dá)1:891;鼻灌洗液中特異性Ig G抗體效為1:8。4.采用微量中和試驗檢測免疫小鼠血清中和抗體滴度結(jié)果顯示:1)PV2/明膠佐劑/滴鼻組的小鼠血清中和抗體滴度達(dá)1:15;PV2/弗氏佐劑/肌肉注射小鼠血清中和抗體滴度達(dá)1:39。環(huán)化PV2/明膠佐劑/滴鼻組小鼠血清中和抗體滴度達(dá)1:63;環(huán)化PV2/弗氏佐劑/肌肉注射組小鼠血清中和抗體滴度達(dá)1:158。F蛋白/明膠佐劑/滴鼻組小鼠血清中和抗體滴度達(dá)1:39;F蛋白/弗氏佐劑/肌肉注射組小鼠血清達(dá)1:1584。2)所有滴鼻免疫組的小鼠血清中和抗體滴度明顯低于肌注免疫組小鼠(P0.05)。5.通過間接免疫熒光測定中和抗體保護(hù)效果,結(jié)果顯示非環(huán)化的PV2/明膠佐劑/滴鼻組無熒光顯示,而PV2/弗氏佐劑/肌肉注射組有一定熒光強(qiáng)度但弱于天然F蛋白免疫組。環(huán)化的PV2肽免疫組熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)強(qiáng)于陰性對照,其中環(huán)化PV2/弗氏佐劑/肌肉注射組熒光強(qiáng)度幾乎與Motabizumab單抗效果相當(dāng)。結(jié)論:1.三種抗原蛋白無論肌注還是滴鼻免疫,都在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生血清特異性Ig G抗體。環(huán)化PV2誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生血清特異性Ig G抗體的能力明顯優(yōu)于非環(huán)化的PV2,但弱于全長F蛋白。2.三種抗原蛋白通過肌注免疫均能誘導(dǎo)小鼠肺中產(chǎn)生特異性Ig G抗體,但僅有環(huán)化PV2和F蛋白能誘導(dǎo)鼻腔產(chǎn)生特異性Ig G抗體。環(huán)化PV2誘導(dǎo)小鼠的肺灌洗液中特異性Ig G抗體效價明顯優(yōu)于非環(huán)化的PV2,但弱于全長F蛋白。3.三種抗原蛋白通過滴鼻免疫方式免疫的小鼠肺灌洗液、鼻灌洗液中均未檢測到特異性Ig G抗體產(chǎn)生。4.無論是肌注免疫還是滴鼻免疫,環(huán)化PV2免疫組小鼠產(chǎn)生的中和抗體滴度均高于PV2免疫組小鼠,但低于F蛋白免疫組小鼠。所有滴鼻免疫組的小鼠血清中和抗體滴度明顯低于肌注免疫組小鼠(P0.05)。5.環(huán)化的PV2肽不管肌注,還是滴鼻免疫小鼠后產(chǎn)生的血清抗體對于天然F蛋白的特異性識別能力優(yōu)于PV2肽。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

ure 1-1. The crystal structure of the monoclonal antibody Motavizumab001 antigen derived from the RSV (blue: Motavizumab, red: FFL-001 pr，單克隆抗體 Motavizumab 與源于 RSV 免疫原 FFL_001 的晶體結(jié)構(gòu)圖（Motavizumab， 紅色：FFL_001 蛋白）。材料與方法料、主要試劑肽溶解液：20mM HEPES, pH 7.2, 0.1% Tween20, 15mM DTT、主要設(shè)備

The stable partion of the RSV F protei圖 1-3，RSV F 蛋白中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定部分。e crystal structure of the RSV F protein with the diff

gure 1-6. Systematic analysis on the non-bonding interaction between otavizumab. There were nine H-bonding interactions and one sation. 1-6，系統(tǒng)分析 FFL-001 肽與 Motavizumab 抗體之間的非鍵作用。其現(xiàn)有 9 個氫鍵作用，一個鹽橋作用。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 何金生;付遠(yuǎn)輝;洪濤;;人呼吸道合胞病毒活疫苗研究進(jìn)展[J];中國科學(xué):生命科學(xué);2011年01期

本文編號：2752385