【摘要】：目的:分別用原核和真核細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(glycoprotein E,g E)的基因胞外域,對(duì)融合蛋白進(jìn)行特異性鑒定和免疫反應(yīng)性分析,將這兩種融合蛋白分別免疫新西蘭家兔,制備兔抗VZV g E多克隆抗體;應(yīng)用融合蛋白作為抗原建立檢測(cè)VZV特異性抗體的血清學(xué)試驗(yàn),開展對(duì)VZV感染的流行病學(xué)調(diào)查,以評(píng)價(jià)VZV疫苗的免疫效果,為易感人群VZV感染的診斷和治療以及水痘預(yù)防措施的制定提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為研制安全性更高的VZV g E亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。方法:從臨床采集帶狀皰疹患者的皮膚囊泡液接種至單層人胚胎成纖維細(xì)胞(human embryo fibroblast,HF),進(jìn)行病毒分離;對(duì)分離的病毒株進(jìn)行特征性細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),間接免疫熒光和DNA測(cè)序鑒定。將確認(rèn)的VZV臨床分離株體外培養(yǎng),PCR擴(kuò)增VZV g E基因胞外域片段,分別構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒g E-p ET-32a(+)和真核表達(dá)質(zhì)粒g E-p CDNA3.1/myc-His(-),測(cè)序后將原核質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,以異丙基硫代β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo),獲得VZV g E原核表達(dá)的融合蛋白。通過SDS-PAGE電泳、Western blot鑒定融合蛋白的特異性,利用Ni2+-NTA柱對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化及柱上復(fù)性。將真核質(zhì)粒用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)VZV g E蛋白的細(xì)胞株,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA柱純化;通過RT-PCR檢測(cè)VZV g E基因的m RNA,Western blot和間接免疫熒光檢測(cè)g E融合蛋白的免疫反應(yīng)性。分別用純化后的原核表達(dá)g E蛋白和真核表達(dá)g E蛋白免疫新西蘭家兔,獲得兔抗VZV g E多克隆抗體。ELISA法分別測(cè)定該抗體及其效價(jià)。應(yīng)用真核細(xì)胞表達(dá)的g E重組抗原包被ELISA酶標(biāo)板,建立VZV抗體檢測(cè)的血清學(xué)試驗(yàn)。對(duì)127份0~10歲正常兒童血清中VZV Ig G抗體水平進(jìn)行檢測(cè),以評(píng)價(jià)VZV疫苗的免疫效果。結(jié)果:利用原核表達(dá),成功誘導(dǎo)表達(dá)出VZV g E融合蛋白,SDS-PAGE鑒定表明其為包涵體表達(dá),表達(dá)量約為3.01 mg/ml,Ni2+-NTA柱純化后,g E蛋白純度約為90%。Western blot顯示,經(jīng)變性、復(fù)性后的該融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。免疫新西蘭家兔后獲得兔抗VZV g E多克隆抗體,ELISA測(cè)定顯示,多克隆抗體效價(jià)為1:6400~1:12800;利用真核表達(dá),成功篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)VZV g E基因胞外域的COS-7細(xì)胞株,RT-PCR檢測(cè)到相應(yīng)的m RNA,間接免疫熒光和Western blot鑒定,該g E融合蛋白具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性;COS-7細(xì)胞株和其培養(yǎng)液中均有g(shù) E融合蛋白,表達(dá)量約為0.632 mg/ml,Ni2+-NTA柱純化后,g E蛋白純度約為90%。免疫新西蘭家兔后獲得兔抗VZV g E多克隆抗體,ELISA測(cè)定顯示,多克隆抗體效價(jià)為1:25600~1:51200。應(yīng)用真核g E抗原包被ELISA板,檢測(cè)了127份0~10歲兒童血清中VZV Ig G抗體,總陽性率為81.89%,特異度和靈敏度分別為93.75%和88.24%。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了穩(wěn)定高效表達(dá)VZV g E蛋白的原核表達(dá)和真核表達(dá)系統(tǒng),獲得較高純度的g E蛋白,有利于全面研究此蛋白的生物學(xué)功能,并為VZV亞單位疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。制備了特異性及效價(jià)較高的兔抗VZV g E多克隆抗體,建立了快速診斷VZV感染的ELISA血清學(xué)試驗(yàn),有助于VZV疫苗免疫效果的監(jiān)測(cè)和VZV感染的流行病學(xué)調(diào)查,為水痘預(yù)防措施的制定提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

患者皮膚囊泡液接種至 HF 細(xì)胞后出現(xiàn) CPE 結(jié)果(×200).A：正常 HF 細(xì)胞；B：V 細(xì)胞（5~7 天）ZV cytopathic effects in HF cells (×200). A: Normal HF cells monolayer; B: VZV incells (5~7 days).

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文原核重組質(zhì)粒 gE-pET-32a(+)和真核重組質(zhì)粒 gE-pCDNA3.1/myc-His(-鑒定PCR 擴(kuò)增的 gE 基因的產(chǎn)物和重組質(zhì)粒 gE-pET-32a(+)被雙酶切后的產(chǎn)物凝膠電泳，均可見 1617 bp 的目的條帶。圖 3、4。該產(chǎn)物經(jīng) DNA 測(cè)序后T 法與 GenBank 數(shù)據(jù)庫比對(duì)，其序列與 VZV Dumas 標(biāo)準(zhǔn)株基因組 DNA 的應(yīng)序列符合率為 100%。圖 5。

重組質(zhì)粒 gE-pCDNA3.1/myc-His(-)的構(gòu)建與酶切鑒定. A：gE 基因胞外域重組質(zhì)粒單、雙酶切鑒定。 M：Marker；1: 目的基因片段；2: 以 ddH2O照；3: 重組質(zhì)粒；4: 重組質(zhì)粒經(jīng) Xhol I 酶切；5: 重組質(zhì)粒經(jīng) HandIII 酶雙酶切。e construction of the gE-pCDNA3.1/myc-His(-) plasmid. A: PCR amplificalar domain; B: Identification of recombinant plasmid with restriction enzymerker; 1:gE extracellular domain gene product; 2: PCR negative cA3.1/myc-His(-) plasmid; 4: Xhol I enzyme digestion; 5: HandIII enzymeand HandIII double enzyme digestion.

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 王敏力;沈琦;;水痘-帶狀皰疹免疫球蛋白研究進(jìn)展[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2007年09期

2 甘霖;王明麗;陳敬賢;;水痘減毒活疫苗的研究進(jìn)展[J];微生物與感染;2009年01期

3 伊興旭;甘霖;陳敬賢;王明麗;;水痘-帶狀皰疹病毒疫苗的評(píng)價(jià)與研究進(jìn)展[J];微生物與感染;2014年04期

本文編號(hào)：2752149