【摘要】：目的:分別用原核和真核細胞穩(wěn)定表達水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus,VZV)糖蛋白E(glycoprotein E,g E)的基因胞外域,對融合蛋白進行特異性鑒定和免疫反應(yīng)性分析,將這兩種融合蛋白分別免疫新西蘭家兔,制備兔抗VZV g E多克隆抗體;應(yīng)用融合蛋白作為抗原建立檢測VZV特異性抗體的血清學試驗,開展對VZV感染的流行病學調(diào)查,以評價VZV疫苗的免疫效果,為易感人群VZV感染的診斷和治療以及水痘預(yù)防措施的制定提供重要的實驗依據(jù),并為研制安全性更高的VZV g E亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。方法:從臨床采集帶狀皰疹患者的皮膚囊泡液接種至單層人胚胎成纖維細胞(human embryo fibroblast,HF),進行病毒分離;對分離的病毒株進行特征性細胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE),間接免疫熒光和DNA測序鑒定。將確認的VZV臨床分離株體外培養(yǎng),PCR擴增VZV g E基因胞外域片段,分別構(gòu)建原核表達質(zhì)粒g E-p ET-32a(+)和真核表達質(zhì)粒g E-p CDNA3.1/myc-His(-),測序后將原核質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞,以異丙基硫代β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導(dǎo),獲得VZV g E原核表達的融合蛋白。通過SDS-PAGE電泳、Western blot鑒定融合蛋白的特異性,利用Ni2+-NTA柱對表達蛋白進行純化及柱上復(fù)性。將真核質(zhì)粒用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至COS-7細胞,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達VZV g E蛋白的細胞株,表達產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA柱純化;通過RT-PCR檢測VZV g E基因的m RNA,Western blot和間接免疫熒光檢測g E融合蛋白的免疫反應(yīng)性。分別用純化后的原核表達g E蛋白和真核表達g E蛋白免疫新西蘭家兔,獲得兔抗VZV g E多克隆抗體。ELISA法分別測定該抗體及其效價。應(yīng)用真核細胞表達的g E重組抗原包被ELISA酶標板,建立VZV抗體檢測的血清學試驗。對127份0~10歲正常兒童血清中VZV Ig G抗體水平進行檢測,以評價VZV疫苗的免疫效果。結(jié)果:利用原核表達,成功誘導(dǎo)表達出VZV g E融合蛋白,SDS-PAGE鑒定表明其為包涵體表達,表達量約為3.01 mg/ml,Ni2+-NTA柱純化后,g E蛋白純度約為90%。Western blot顯示,經(jīng)變性、復(fù)性后的該融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。免疫新西蘭家兔后獲得兔抗VZV g E多克隆抗體,ELISA測定顯示,多克隆抗體效價為1:6400~1:12800;利用真核表達,成功篩選出能夠穩(wěn)定表達VZV g E基因胞外域的COS-7細胞株,RT-PCR檢測到相應(yīng)的m RNA,間接免疫熒光和Western blot鑒定,該g E融合蛋白具有較強的免疫反應(yīng)性;COS-7細胞株和其培養(yǎng)液中均有g(shù) E融合蛋白,表達量約為0.632 mg/ml,Ni2+-NTA柱純化后,g E蛋白純度約為90%。免疫新西蘭家兔后獲得兔抗VZV g E多克隆抗體,ELISA測定顯示,多克隆抗體效價為1:25600~1:51200。應(yīng)用真核g E抗原包被ELISA板,檢測了127份0~10歲兒童血清中VZV Ig G抗體,總陽性率為81.89%,特異度和靈敏度分別為93.75%和88.24%。結(jié)論:本實驗成功構(gòu)建了穩(wěn)定高效表達VZV g E蛋白的原核表達和真核表達系統(tǒng),獲得較高純度的g E蛋白,有利于全面研究此蛋白的生物學功能,并為VZV亞單位疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。制備了特異性及效價較高的兔抗VZV g E多克隆抗體,建立了快速診斷VZV感染的ELISA血清學試驗,有助于VZV疫苗免疫效果的監(jiān)測和VZV感染的流行病學調(diào)查,為水痘預(yù)防措施的制定提供了重要的實驗依據(jù)。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【圖文】：

患者皮膚囊泡液接種至 HF 細胞后出現(xiàn) CPE 結(jié)果(×200).A：正常 HF 細胞；B：V 細胞（5~7 天）ZV cytopathic effects in HF cells (×200). A: Normal HF cells monolayer; B: VZV incells (5~7 days).

安徽醫(yī)科大學碩士學位論文原核重組質(zhì)粒 gE-pET-32a(+)和真核重組質(zhì)粒 gE-pCDNA3.1/myc-His(-鑒定PCR 擴增的 gE 基因的產(chǎn)物和重組質(zhì)粒 gE-pET-32a(+)被雙酶切后的產(chǎn)物凝膠電泳，均可見 1617 bp 的目的條帶。圖 3、4。該產(chǎn)物經(jīng) DNA 測序后T 法與 GenBank 數(shù)據(jù)庫比對，其序列與 VZV Dumas 標準株基因組 DNA 的應(yīng)序列符合率為 100%。圖 5。

重組質(zhì)粒 gE-pCDNA3.1/myc-His(-)的構(gòu)建與酶切鑒定. A：gE 基因胞外域重組質(zhì)粒單、雙酶切鑒定。 M：Marker；1: 目的基因片段；2: 以 ddH2O照；3: 重組質(zhì)粒；4: 重組質(zhì)粒經(jīng) Xhol I 酶切；5: 重組質(zhì)粒經(jīng) HandIII 酶雙酶切。e construction of the gE-pCDNA3.1/myc-His(-) plasmid. A: PCR amplificalar domain; B: Identification of recombinant plasmid with restriction enzymerker; 1:gE extracellular domain gene product; 2: PCR negative cA3.1/myc-His(-) plasmid; 4: Xhol I enzyme digestion; 5: HandIII enzymeand HandIII double enzyme digestion.

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 王敏力;沈琦;;水痘-帶狀皰疹免疫球蛋白研究進展[J];中國生物制品學雜志;2007年09期

2 甘霖;王明麗;陳敬賢;;水痘減毒活疫苗的研究進展[J];微生物與感染;2009年01期

3 伊興旭;甘霖;陳敬賢;王明麗;;水痘-帶狀皰疹病毒疫苗的評價與研究進展[J];微生物與感染;2014年04期

本文編號：2752149