【摘要】：【背景和目的】21世紀(jì)以來(lái),在全球引起痢疾的主要病原體是宋內(nèi)氏志賀菌,由于志賀菌耐受胃酸,極少量的志賀菌(10-100個(gè))感染機(jī)體后,可穿透腸屏障,快速侵入結(jié)直腸引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)菌性痢疾。據(jù)流行病學(xué)研究報(bào)道,全世界每年菌痢發(fā)生例約有1.6億,主要集中在5歲以下的兒童,全世界每年因痢疾而死亡的人數(shù)約達(dá)100萬(wàn)。最新文獻(xiàn)表明,宋內(nèi)氏志賀菌還可通過(guò)性傳播途徑感染,可編碼志賀毒素,而且產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的多重耐藥宋內(nèi)氏志賀菌與非結(jié)石性膽囊炎的發(fā)生密切相關(guān)。因此迫切需要從志賀菌本身特性以及致病機(jī)制方面進(jìn)行研究。宋內(nèi)氏志賀菌具有210 kb的毒性質(zhì)粒,此質(zhì)粒編碼一種親脂多糖(LPS)的O抗原基因簇。然而,這種毒性質(zhì)粒在感染過(guò)程中卻經(jīng)常丟失。那么對(duì)宋內(nèi)氏志賀菌來(lái)說(shuō),其感染的優(yōu)勢(shì)是否是丟失其毒性質(zhì)粒?大多數(shù)革蘭氏陰性的腸道細(xì)菌能表達(dá)完整的LPS(其結(jié)構(gòu)由內(nèi)而外包含脂質(zhì)A、核心多糖core、O抗原三部分組成),細(xì)菌失去O抗原會(huì)變成為粗糙型菌落,也就是革蘭氏陰性細(xì)菌在其表面表達(dá)了一個(gè)LPS core(LOS)。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果表明,淋病奈瑟菌和鼠疫耶爾森氏菌等本身不表達(dá)O抗原的革蘭氏陰性菌可通過(guò)LOS與CD209相互作用;另外假結(jié)核耶爾森氏菌和傷寒沙門氏菌等本身具有O抗原的病原菌在人為條件下不表達(dá)O抗原時(shí),能夠通過(guò)LOS與CD209相互作用侵襲抗原提呈細(xì)胞(APCs)。而宋內(nèi)氏志賀菌在其復(fù)制過(guò)程中極易自然地丟掉O抗原合成基因進(jìn)而暴露LPS core,那么宋內(nèi)氏志賀菌是否也可通過(guò)這一方式可與機(jī)體免疫細(xì)胞相互作用呢?本研究從宿主-病原微生物相互作用的角度,提出了失去210kb的毒質(zhì)粒的宋內(nèi)氏志賀菌(rough)以其外膜蛋白核心寡糖的某些成分為配體,與宿主細(xì)胞表面一類C型凝集素受體相互結(jié)合,促進(jìn)了宋內(nèi)氏志賀菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附和侵襲,而在感染過(guò)程中這種相互作用很有可能有助于機(jī)體對(duì)粗糙型的宋內(nèi)氏志賀菌進(jìn)行清除,同時(shí)我們推測(cè),可能也有很少一部分的宋內(nèi)氏志賀菌能夠利用和鼠疫耶爾森菌相同的感染機(jī)制侵入APCs并逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視�！痉椒ā�1.剛果紅平板篩選宋內(nèi)氏志賀菌光滑型和粗糙型利用宋內(nèi)氏志賀菌在生長(zhǎng)條件下可自然丟失毒性質(zhì)粒的特性獲得光滑型和粗糙型,運(yùn)用剛果紅可與細(xì)菌三型分泌系統(tǒng)(T3SS)編碼的毒力蛋白結(jié)合進(jìn)而驗(yàn)證,有毒株呈現(xiàn)紅色菌落,而無(wú)毒株為無(wú)色菌落。2.基因檢測(cè)宋內(nèi)氏志賀菌光滑型和粗糙型選擇編碼宋內(nèi)氏志賀菌的特有基因、210kb毒性質(zhì)�；蚣癘抗原編碼基因設(shè)計(jì)引物,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)鑒定光滑型和粗糙型菌株。3.宋內(nèi)氏志賀菌脂多糖LPS表型的分析提取并純化細(xì)菌脂多糖LPS,用SDS-PAGE銀染的方法檢測(cè)細(xì)菌O抗原的表達(dá)情況。4.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)3.1用大腸桿菌K12粗糙型CS180及表達(dá)O抗原的光滑型CS1861做對(duì)照,用宋內(nèi)氏志賀菌光滑型Ss-WT及丟失毒性質(zhì)粒后的粗糙型Ss-rough侵襲C57BL/6小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,利用慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)菌感染細(xì)胞1.5小時(shí)后丟失毒性質(zhì)粒的粗糙型Ss-rough(無(wú)侵襲基因的無(wú)毒株)對(duì)巨噬細(xì)胞的侵襲能力。3.2用大腸桿菌K12粗糙型CS180及表達(dá)O抗原的光滑型CS1861做對(duì)照,用宋內(nèi)氏志賀菌光滑型Ss-WT及丟失毒性質(zhì)粒后的粗糙型Ss-rough侵襲人腸道分離的樹(shù)突狀細(xì)胞,利用慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)菌感染細(xì)胞1.5小時(shí)后丟失毒性質(zhì)粒的粗糙型Ss-rough對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的侵襲能力。3.3用大腸桿菌K12粗糙型CS180及假結(jié)核耶爾森氏菌Y1作為對(duì)照,用宋內(nèi)氏志賀菌光滑型Ss-WT,丟失毒性質(zhì)粒后的粗糙型Ss-rough及人工構(gòu)建表達(dá)O抗原的宋內(nèi)氏志賀菌roughO~+侵襲表達(dá)鼠CD209b,人CD209a和人CD207受體的CHO細(xì)胞,利用慶大霉素保護(hù)實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)菌感染細(xì)胞2小時(shí)后侵襲進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的菌量,確定宋內(nèi)氏志賀菌粗糙型Ss-rough是否是通過(guò)與固有免疫細(xì)胞表面受體CD209/CD207相互作用進(jìn)而進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞內(nèi)的。5.細(xì)胞侵襲抑制實(shí)驗(yàn)用細(xì)菌脂多糖類似物及特異性的抗細(xì)胞表面分子抗體先與細(xì)胞相互作用,然后再進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn),觀察感染2小時(shí)后侵襲進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的菌量,以此確定宋內(nèi)氏志賀菌丟失毒性質(zhì)粒后的粗糙型Ss-rough與細(xì)胞表面受體是否為特異性相互作用,是否Ss-rough的脂多糖核心LPS core參與同CD209和CD207的相互作用。6.動(dòng)物感染體內(nèi)實(shí)驗(yàn)腹腔注射途徑,用適當(dāng)劑量的宋內(nèi)氏志賀菌光滑型Ss-WT,丟失毒性質(zhì)粒后的粗糙型Ss-rough及人工構(gòu)建表達(dá)O抗原的宋內(nèi)氏志賀菌roughO~+直接注射入腹腔感染C57BL/6小鼠,24小時(shí)后觀察細(xì)菌在體內(nèi)的播散情況�！窘Y(jié)果】1.光滑型和粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌的篩選及鑒定利用剛果紅平板法培養(yǎng)野生型宋內(nèi)氏志賀菌,通過(guò)隨機(jī)挑選若干菌落并用特異性引物鑒定得到了丟失毒性質(zhì)粒的粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌Ss-rough。2.丟失毒性質(zhì)粒后的宋內(nèi)氏志賀菌不表達(dá)O抗原銀染法結(jié)果表明,丟失毒性質(zhì)粒后的宋內(nèi)氏志賀菌Ss-rough不表達(dá)O抗原。3.丟失毒性質(zhì)粒促進(jìn)粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌侵襲小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和人腸道樹(shù)突狀細(xì)胞宋內(nèi)氏志賀菌光滑型Ss-WT和丟失毒性質(zhì)粒的粗糙型Ss-rough均可侵入抗原提呈細(xì)胞,且與光滑型相比,丟失毒性質(zhì)粒的粗糙型Ss-rough侵入抗原提呈細(xì)胞更多。4.CD209和CD207是粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌侵入抗原提呈細(xì)胞的受體與CHO細(xì)胞相比,宋內(nèi)氏志賀菌粗糙型Ss-rough可侵入表達(dá)mCD209(mSIGNR1),hCD209(hDC-SIGN),hCD207(hLangerin)分子的CHO轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。表明粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌Ss-rough可與CD209和hCD207相互作用,而且O抗原可降低他們之間的相互作用。5.粗糙型的宋內(nèi)氏志賀菌與CD209/hCD207的相互作用是特異性的抗CD209和抗hCD207單克隆抗體可抑制宋內(nèi)氏志賀菌與CD209和hCD207之間的相互作用,但這種相互作用不能被甘露聚糖(細(xì)菌脂多糖類似物)所抑制。表明粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌Ss-rough與受體的相互作用是特異性的,但可能不是利用類似于鼠疫耶爾森的感染機(jī)制通過(guò)core LPS與受體相互作用的。6.表達(dá)O抗原可以降低粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌播散至腸系膜淋巴結(jié)和脾臟的能力通過(guò)對(duì)感染細(xì)菌24h后的小鼠內(nèi)臟中的細(xì)菌數(shù)目進(jìn)行比較,觀察到宋內(nèi)氏志賀菌丟失毒性質(zhì)粒后仍能侵入周圍組織,且O抗原可抑制粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌Ss-rough進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)和脾臟。【總結(jié)】本研究證明了丟失毒性質(zhì)粒后的宋內(nèi)氏志賀菌可與C型凝集素受體CD209和CD207相互作用進(jìn)入抗原提呈細(xì)胞內(nèi)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R378
【圖文】：

33圖 1. 大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和宋內(nèi)氏志賀菌的脂多糖結(jié)構(gòu)及其合成基因Figure 1. Structures of inner- and outer-core regions of the LPS orLOS of E. coli K12, S. typhimurium, and S. sonnei and the genes involved in their synthesis.

34圖 2. PCR 鑒定光滑型和粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌（a） 引物特異性針對(duì)宋內(nèi)氏志賀菌基因（shigella），產(chǎn)物片段大小為 500bp; （b）引物為針對(duì)宋內(nèi)氏志賀菌毒性質(zhì)粒上編碼 O 抗原的基因（wzy），產(chǎn)物大小為234bpFigure 2. The smooth type and rough type were identified by PCR（a） the primer is the specific shigella genes; （b）The primer is O antigen codinggene (wzy) on the plasmid.注：圖中陽(yáng)為宋內(nèi)氏志賀菌陽(yáng)性對(duì)照；ST 為鼠傷寒沙門氏菌。

35圖 3. SDS-PAGE 銀染對(duì)宋內(nèi)氏志賀菌脂多糖表型分析Figure 3. Analysis of LPS phenotype of S. sonnei注：圖中 CS180 是不表達(dá) O 抗原的大腸桿菌；CS1861 是將 pSS37（攜帶痢疾志賀菌的 O 抗原全部基因）轉(zhuǎn)入 CS180 的大腸桿菌，可表達(dá) O 抗原；Ss-rough 是丟失毒性質(zhì)粒后的宋內(nèi)氏志賀菌，不再表達(dá) O 抗原；Ss-WT 是野生型宋內(nèi)氏志賀菌，具有毒性質(zhì)粒，表達(dá) O 抗原；roughO+是是將 pSS37（攜帶痢疾志賀菌的 O 抗原全部基因）轉(zhuǎn)入 Ss-rough 的宋內(nèi)氏志賀菌，不含有毒性質(zhì)粒，可表達(dá) O 抗原。

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本文編號(hào)：2752519