【摘要】：【背景和目的】21世紀以來,在全球引起痢疾的主要病原體是宋內(nèi)氏志賀菌,由于志賀菌耐受胃酸,極少量的志賀菌(10-100個)感染機體后,可穿透腸屏障,快速侵入結(jié)直腸引起強烈的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致細菌性痢疾。據(jù)流行病學(xué)研究報道,全世界每年菌痢發(fā)生例約有1.6億,主要集中在5歲以下的兒童,全世界每年因痢疾而死亡的人數(shù)約達100萬。最新文獻表明,宋內(nèi)氏志賀菌還可通過性傳播途徑感染,可編碼志賀毒素,而且產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶的多重耐藥宋內(nèi)氏志賀菌與非結(jié)石性膽囊炎的發(fā)生密切相關(guān)。因此迫切需要從志賀菌本身特性以及致病機制方面進行研究。宋內(nèi)氏志賀菌具有210 kb的毒性質(zhì)粒,此質(zhì)粒編碼一種親脂多糖(LPS)的O抗原基因簇。然而,這種毒性質(zhì)粒在感染過程中卻經(jīng)常丟失。那么對宋內(nèi)氏志賀菌來說,其感染的優(yōu)勢是否是丟失其毒性質(zhì)粒?大多數(shù)革蘭氏陰性的腸道細菌能表達完整的LPS(其結(jié)構(gòu)由內(nèi)而外包含脂質(zhì)A、核心多糖core、O抗原三部分組成),細菌失去O抗原會變成為粗糙型菌落,也就是革蘭氏陰性細菌在其表面表達了一個LPS core(LOS)。本實驗室前期的研究結(jié)果表明,淋病奈瑟菌和鼠疫耶爾森氏菌等本身不表達O抗原的革蘭氏陰性菌可通過LOS與CD209相互作用;另外假結(jié)核耶爾森氏菌和傷寒沙門氏菌等本身具有O抗原的病原菌在人為條件下不表達O抗原時,能夠通過LOS與CD209相互作用侵襲抗原提呈細胞(APCs)。而宋內(nèi)氏志賀菌在其復(fù)制過程中極易自然地丟掉O抗原合成基因進而暴露LPS core,那么宋內(nèi)氏志賀菌是否也可通過這一方式可與機體免疫細胞相互作用呢?本研究從宿主-病原微生物相互作用的角度,提出了失去210kb的毒質(zhì)粒的宋內(nèi)氏志賀菌(rough)以其外膜蛋白核心寡糖的某些成分為配體,與宿主細胞表面一類C型凝集素受體相互結(jié)合,促進了宋內(nèi)氏志賀菌對宿主細胞的黏附和侵襲,而在感染過程中這種相互作用很有可能有助于機體對粗糙型的宋內(nèi)氏志賀菌進行清除,同時我們推測,可能也有很少一部分的宋內(nèi)氏志賀菌能夠利用和鼠疫耶爾森菌相同的感染機制侵入APCs并逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。【方法】1.剛果紅平板篩選宋內(nèi)氏志賀菌光滑型和粗糙型利用宋內(nèi)氏志賀菌在生長條件下可自然丟失毒性質(zhì)粒的特性獲得光滑型和粗糙型,運用剛果紅可與細菌三型分泌系統(tǒng)(T3SS)編碼的毒力蛋白結(jié)合進而驗證,有毒株呈現(xiàn)紅色菌落,而無毒株為無色菌落。2.基因檢測宋內(nèi)氏志賀菌光滑型和粗糙型選擇編碼宋內(nèi)氏志賀菌的特有基因、210kb毒性質(zhì)�；蚣癘抗原編碼基因設(shè)計引物,多聚酶鏈式反應(yīng)(PCR)鑒定光滑型和粗糙型菌株。3.宋內(nèi)氏志賀菌脂多糖LPS表型的分析提取并純化細菌脂多糖LPS,用SDS-PAGE銀染的方法檢測細菌O抗原的表達情況。4.細胞侵襲實驗3.1用大腸桿菌K12粗糙型CS180及表達O抗原的光滑型CS1861做對照,用宋內(nèi)氏志賀菌光滑型Ss-WT及丟失毒性質(zhì)粒后的粗糙型Ss-rough侵襲C57BL/6小鼠的腹腔巨噬細胞,利用慶大霉素保護實驗觀察細菌感染細胞1.5小時后丟失毒性質(zhì)粒的粗糙型Ss-rough(無侵襲基因的無毒株)對巨噬細胞的侵襲能力。3.2用大腸桿菌K12粗糙型CS180及表達O抗原的光滑型CS1861做對照,用宋內(nèi)氏志賀菌光滑型Ss-WT及丟失毒性質(zhì)粒后的粗糙型Ss-rough侵襲人腸道分離的樹突狀細胞,利用慶大霉素保護實驗觀察細菌感染細胞1.5小時后丟失毒性質(zhì)粒的粗糙型Ss-rough對樹突狀細胞的侵襲能力。3.3用大腸桿菌K12粗糙型CS180及假結(jié)核耶爾森氏菌Y1作為對照,用宋內(nèi)氏志賀菌光滑型Ss-WT,丟失毒性質(zhì)粒后的粗糙型Ss-rough及人工構(gòu)建表達O抗原的宋內(nèi)氏志賀菌roughO~+侵襲表達鼠CD209b,人CD209a和人CD207受體的CHO細胞,利用慶大霉素保護實驗觀察細菌感染細胞2小時后侵襲進入細胞內(nèi)的菌量,確定宋內(nèi)氏志賀菌粗糙型Ss-rough是否是通過與固有免疫細胞表面受體CD209/CD207相互作用進而進入抗原提呈細胞內(nèi)的。5.細胞侵襲抑制實驗用細菌脂多糖類似物及特異性的抗細胞表面分子抗體先與細胞相互作用,然后再進行侵襲實驗,觀察感染2小時后侵襲進入細胞內(nèi)的菌量,以此確定宋內(nèi)氏志賀菌丟失毒性質(zhì)粒后的粗糙型Ss-rough與細胞表面受體是否為特異性相互作用,是否Ss-rough的脂多糖核心LPS core參與同CD209和CD207的相互作用。6.動物感染體內(nèi)實驗腹腔注射途徑,用適當(dāng)劑量的宋內(nèi)氏志賀菌光滑型Ss-WT,丟失毒性質(zhì)粒后的粗糙型Ss-rough及人工構(gòu)建表達O抗原的宋內(nèi)氏志賀菌roughO~+直接注射入腹腔感染C57BL/6小鼠,24小時后觀察細菌在體內(nèi)的播散情況�！窘Y(jié)果】1.光滑型和粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌的篩選及鑒定利用剛果紅平板法培養(yǎng)野生型宋內(nèi)氏志賀菌,通過隨機挑選若干菌落并用特異性引物鑒定得到了丟失毒性質(zhì)粒的粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌Ss-rough。2.丟失毒性質(zhì)粒后的宋內(nèi)氏志賀菌不表達O抗原銀染法結(jié)果表明,丟失毒性質(zhì)粒后的宋內(nèi)氏志賀菌Ss-rough不表達O抗原。3.丟失毒性質(zhì)粒促進粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌侵襲小鼠腹腔巨噬細胞和人腸道樹突狀細胞宋內(nèi)氏志賀菌光滑型Ss-WT和丟失毒性質(zhì)粒的粗糙型Ss-rough均可侵入抗原提呈細胞,且與光滑型相比,丟失毒性質(zhì)粒的粗糙型Ss-rough侵入抗原提呈細胞更多。4.CD209和CD207是粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌侵入抗原提呈細胞的受體與CHO細胞相比,宋內(nèi)氏志賀菌粗糙型Ss-rough可侵入表達mCD209(mSIGNR1),hCD209(hDC-SIGN),hCD207(hLangerin)分子的CHO轉(zhuǎn)染細胞系。表明粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌Ss-rough可與CD209和hCD207相互作用,而且O抗原可降低他們之間的相互作用。5.粗糙型的宋內(nèi)氏志賀菌與CD209/hCD207的相互作用是特異性的抗CD209和抗hCD207單克隆抗體可抑制宋內(nèi)氏志賀菌與CD209和hCD207之間的相互作用,但這種相互作用不能被甘露聚糖(細菌脂多糖類似物)所抑制。表明粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌Ss-rough與受體的相互作用是特異性的,但可能不是利用類似于鼠疫耶爾森的感染機制通過core LPS與受體相互作用的。6.表達O抗原可以降低粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌播散至腸系膜淋巴結(jié)和脾臟的能力通過對感染細菌24h后的小鼠內(nèi)臟中的細菌數(shù)目進行比較,觀察到宋內(nèi)氏志賀菌丟失毒性質(zhì)粒后仍能侵入周圍組織,且O抗原可抑制粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌Ss-rough進入腸系膜淋巴結(jié)和脾臟。【總結(jié)】本研究證明了丟失毒性質(zhì)粒后的宋內(nèi)氏志賀菌可與C型凝集素受體CD209和CD207相互作用進入抗原提呈細胞內(nèi)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R378
【圖文】：

33圖 1. 大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和宋內(nèi)氏志賀菌的脂多糖結(jié)構(gòu)及其合成基因Figure 1. Structures of inner- and outer-core regions of the LPS orLOS of E. coli K12, S. typhimurium, and S. sonnei and the genes involved in their synthesis.

34圖 2. PCR 鑒定光滑型和粗糙型宋內(nèi)氏志賀菌（a） 引物特異性針對宋內(nèi)氏志賀菌基因（shigella），產(chǎn)物片段大小為 500bp; （b）引物為針對宋內(nèi)氏志賀菌毒性質(zhì)粒上編碼 O 抗原的基因（wzy），產(chǎn)物大小為234bpFigure 2. The smooth type and rough type were identified by PCR（a） the primer is the specific shigella genes; （b）The primer is O antigen codinggene (wzy) on the plasmid.注：圖中陽為宋內(nèi)氏志賀菌陽性對照；ST 為鼠傷寒沙門氏菌。

35圖 3. SDS-PAGE 銀染對宋內(nèi)氏志賀菌脂多糖表型分析Figure 3. Analysis of LPS phenotype of S. sonnei注：圖中 CS180 是不表達 O 抗原的大腸桿菌；CS1861 是將 pSS37（攜帶痢疾志賀菌的 O 抗原全部基因）轉(zhuǎn)入 CS180 的大腸桿菌，可表達 O 抗原；Ss-rough 是丟失毒性質(zhì)粒后的宋內(nèi)氏志賀菌，不再表達 O 抗原；Ss-WT 是野生型宋內(nèi)氏志賀菌，具有毒性質(zhì)粒，表達 O 抗原；roughO+是是將 pSS37（攜帶痢疾志賀菌的 O 抗原全部基因）轉(zhuǎn)入 Ss-rough 的宋內(nèi)氏志賀菌，不含有毒性質(zhì)粒，可表達 O 抗原。

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本文編號：2752519