【摘要】：目的建立實(shí)驗(yàn)需要的原代早產(chǎn)新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(Alveolar epithelial typeⅡcell,AECⅡ)模型,進(jìn)一步探索細(xì)胞分離純化和培養(yǎng)的方法,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)高體積分?jǐn)?shù)氧誘導(dǎo)AECⅡ損傷和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)干預(yù)高體積分?jǐn)?shù)氧誘導(dǎo)AECⅡ損傷細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。探討CGRP對高體積分?jǐn)?shù)氧(即氧體積分?jǐn)?shù)大于95%)暴露下的早產(chǎn)新生大鼠AECⅡ的影響及其意義。CGRP對高體積分?jǐn)?shù)氧誘導(dǎo)AECⅡ損傷的保護(hù)作用是否涉及Notch信號通路,觀察Notch信號通路中Notch1、Hes和HERP信號分子的改變。探明外源性神經(jīng)肽類遞質(zhì)在高氧AECⅡ損傷時對Notch信號通路影響,為可能的治療提供藥物靶點(diǎn)。方法用孕19d的SPF級SD早產(chǎn)新生鼠的肺組織為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來源,解剖早產(chǎn)新生鼠快速取出其肺組織并剪碎先后用胰蛋白酶聯(lián)合DNA酶和膠原酶Ⅰ消化肺組織。采用差速離心和差速貼壁的方法純化AECⅡ,然后以Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基/F12營養(yǎng)混合物(Dulbecco’s modified Eagle’s medium:Nutrientmixture F12,DMEM/F12)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)(胎牛血清濃度為10%)。臺盼藍(lán)染色檢測AECⅡ活力,巴氏染色檢測AECⅡ純度。早產(chǎn)大鼠原代AECⅡ分離純化后,隨機(jī)分為常氧組、高氧組、高氧+CGRP組、高氧+Gamma分泌酶抑制劑MW167組、高氧+CGRP+CGRP8-37組、高氧+Gamma分泌酶抑制劑MW167+CGRP組。常氧組在空氣下培養(yǎng),高氧組在氧體積分?jǐn)?shù)大于95%的氧氣下培養(yǎng)。體外培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察AECⅡ的細(xì)胞形態(tài)變化,CCK8檢測法檢測細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞檢測法檢測各組AECⅠ和AECⅡ細(xì)胞凋亡情況,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutas,SOD)分別檢測氧化損傷及抗氧化損傷分析,用Western blot方法檢測Notch1、Hes和HERP蛋白表達(dá)水平,QPCR檢測Notch1、Hes和HERP mRNA表達(dá)情況。結(jié)果1.原代培養(yǎng)的AECⅡ產(chǎn)量較好,每只早產(chǎn)新生鼠可獲得的肺組織中AECⅡ的數(shù)量為(8.2±1.2)×10~6,細(xì)胞的活力為(95.5±1.6)%;細(xì)胞純度鑒定為(95.7±2.2)%。2.與常氧組比較,高氧組AECⅡ存活率及SOD含量明顯下降,凋亡率及MDA含量升高(P0.05);高氧+CGRP組與高氧組比較,AECⅡ凋亡率下降,存活率增加,下調(diào)MDA,上調(diào)SOD,CGRP8-37能阻斷CGRP的生物學(xué)作用。3.與常氧組比較,高氧處理組Notch1、Hes和HERP蛋白及mRNA表達(dá)顯著下降(P0.05);與高氧組比較,高氧+CGRP組肺泡細(xì)胞中Notch1、Hes和HERP蛋白及mRNA表達(dá)增加(P0.05);與高氧+CGRP處理組比較,高氧+CGRP及其拮抗劑組Notch1、Hes和HERP蛋白及mRNA表達(dá)反而下降接近高氧組水平(P0.05);與高氧+CGRP處理組比較高氧+CGRP+MW167組Notch1、Hes和HERP蛋白及mRNA表達(dá)下降接近高氧組水平(P0.05)。結(jié)論1.通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)改良,采用差速貼壁及離心去分離和純化,培養(yǎng)的AECⅡ,細(xì)胞純度高,活力較前方法好,死亡率低,可用于AECⅡ等相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。2.通過成功制作高體積分?jǐn)?shù)氧暴露下AECⅡ損傷模型,發(fā)現(xiàn)CGRP有部分抗氧化應(yīng)激的能力,在高體積分?jǐn)?shù)氧的情況下可促進(jìn)AECⅡ的增殖,對損傷的AECⅡ具有一定的保護(hù)作用。3.研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路可能參與了高體積分?jǐn)?shù)氧暴露下AECⅡ損傷修復(fù)過程,CGRP對損傷后的AECⅡ具有一定的保護(hù)作用可能與Notch信號通路的激活有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R722.6;R-332
【圖文】：

圖 2.1 顯微鏡下AECⅡ（×10） 圖 2.2 臺盼藍(lán)染色（×100）Fig 2.1AECⅡunder the microscope(×10) Fig 2.2 Trypan blue staining ofAECⅡ(×100)

顯微鏡下觀察 AECⅡ培養(yǎng)狀態(tài)良好(見圖 2.1)。臺盼藍(lán)染色法檢測 AECⅡ活力為(95.5±1.6)％(見圖2.2)。2.3.2 顯微鏡下觀察 AECⅡ的病理改變及細(xì)胞純度的檢測采用巴氏染色后在倒置顯微鏡下觀察，AECⅡ內(nèi)含板層小體且屬于非角化細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)成深藍(lán)色或綠色，而角化細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)被染成粉紅色或橘紅色，提示培養(yǎng)分離出來的 AECⅡ是純的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，細(xì)胞純度鑒定為（95.7±2.2）％(見圖 2.3)。

圖2.3：巴氏染色檢測大鼠肺泡上皮細(xì)胞AEC II純度(×100)Fig 2.3Modified Papanicolaou stain for detection of AEC II purity in rat alveolar epithelial cells(×100)

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本文編號：2750841