發(fā)布時(shí)間：2020-07-07 03:36

【摘要】：支氣管肺發(fā)育不良(BPD)是嬰兒最常見(jiàn)的慢性肺疾病(CLD)之一,經(jīng)典型BPD首先作為因氧氣和機(jī)械通氣導(dǎo)致的肺損傷由Northway團(tuán)隊(duì)于1967年描述并定義的。盡管近幾十年來(lái)主要治療措施取得進(jìn)展,BPD發(fā)病率仍較高。然而預(yù)防和治療BPD的方式仍非常有限,藥物治療主要是減輕癥狀,而效果不理想,因此重新啟動(dòng)肺泡生長(zhǎng)和誘導(dǎo)肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)育的治療策略將成為治療目標(biāo)。FGF-10是一種旁分泌細(xì)胞因子,主要表達(dá)于間充質(zhì)細(xì)胞,調(diào)節(jié)間質(zhì)-上皮相互作用信號(hào),它參與多種組織器官的發(fā)育和損傷修復(fù)過(guò)程,并具有重要作用,尤其在肺發(fā)育和損傷修復(fù)過(guò)程中作用顯著。本項(xiàng)研究首先建立高氧誘導(dǎo)的新生小鼠BPD模型,之后對(duì)BPD模型小鼠肺中FGF-10的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),再將BPD模型小鼠肺細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),進(jìn)一步檢測(cè)FGF-10是否對(duì)細(xì)胞炎性因子、間充質(zhì)干細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞有影響。初步探討FGF-10與NF-κB相互作用關(guān)系。構(gòu)建pCDHFGF10載體,并檢測(cè)其表達(dá),為下一步研究FGF-10預(yù)防和治療BPD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為以下五部分:研究?jī)?nèi)容一:將80只2日齡昆明小鼠平均隨機(jī)分配到箱內(nèi)氧濃度維持60%-70%的高氧組和空氣組。高氧組小鼠置于底部鋪有鈉石灰以吸附CO_2的自制密閉養(yǎng)殖箱,維持CO_2濃度0.5%。兩組均乳母鼠共處以哺乳新生小鼠,將兩組母鼠每日交換以防母鼠高氧不耐受而死亡。建立新生小鼠BPD模型。生后21天時(shí),高氧組小鼠體型偏小,體重增長(zhǎng)不理想;毛發(fā)不光順,離氧后精神煩躁,出現(xiàn)呼吸困難及口唇、趾端紫紺表現(xiàn)。高氧組小鼠肺HE染色可見(jiàn)其結(jié)構(gòu)逐漸出現(xiàn)BPD樣表現(xiàn),早期可見(jiàn)肺泡間隔增厚、出血及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),后期可見(jiàn)肺泡數(shù)量減少、肺泡融合形成及炎性不張,證明高氧誘導(dǎo)的新生小鼠BPD模型建立成功。研究?jī)?nèi)容二:為研究FGF-10在BPD中的作用,我們首先檢測(cè)了FGF-10在新生小鼠BPD模型中的表達(dá)情況。我們使用免疫組化法分別檢測(cè)4天、7天、14天、21天的高氧組和空氣組小鼠鼠肺,結(jié)果顯示,生后21天時(shí),高氧組小鼠鼠肺中FGF-10表達(dá)明顯減少。進(jìn)而,我們將相應(yīng)日齡的兩組小鼠鼠肺進(jìn)行RT-PCR和Western Blot檢測(cè)。生后21天時(shí)高氧組小鼠FGF-10 mRNA水平明顯減少。Western Blot結(jié)果顯示,高氧組小鼠FGF-10表達(dá)隨著日齡增加而逐漸減少。這表明高氧誘導(dǎo)的BPD模型小鼠肺FGF-10 mRNA水平和蛋白水平減低。研究?jī)?nèi)容三:為檢測(cè)外源性補(bǔ)充FGF-10因子是否對(duì)BPD有改善作用,我們將空氣組與高氧組小鼠鼠肺分為normoxia、normoxia+FGF-10、hyperoxia、hyperoxia+FGF-10四組進(jìn)行體外培養(yǎng)。進(jìn)而使用ELISA法檢測(cè)各組上清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-2、TGF-β等6個(gè)炎性細(xì)胞因子的表達(dá),檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hyperoxia組,IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-2、TGF-β均明顯升高,而加入FGF-10可逆轉(zhuǎn)IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-2、TNF-α的升高,提示FGF-10可減輕體外培養(yǎng)肺細(xì)胞炎癥反應(yīng)。為檢測(cè)FGF-10能否對(duì)外培養(yǎng)肺間充質(zhì)干細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞具有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用,我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD29~+CD90~+雙陽(yáng)性與CD34~-CD105~+單陽(yáng)性的細(xì)胞表面分子標(biāo)志物,結(jié)果顯示,hyperoxia組CD29~+CD90~+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例最低,hyperoxia+FGF-10組雙陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯升高;肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,通過(guò)免疫熒光檢測(cè),發(fā)現(xiàn)hyperoxia組SPC表達(dá)減少,hyperoxia+FGF-10組SP-C表達(dá)明顯增高,證明FGF-10具有促進(jìn)肺間充質(zhì)干細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的作用,說(shuō)明FGF-10可通過(guò)此過(guò)程修復(fù)肺損傷。研究?jī)?nèi)容四:研究報(bào)道NF-κB抑制FGF-10表達(dá),而我們研究發(fā)現(xiàn)FGF-10可減低炎性因子表達(dá),因此我們?cè)O(shè)想FGF-10是否反饋抑制NF-κB表達(dá)。高氧組小鼠鼠肺NF-κB p65的表達(dá)通過(guò)免疫組化來(lái)檢測(cè),加入FGF-10對(duì)體外培養(yǎng)小鼠肺細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá)情況通過(guò)Western Blot來(lái)檢測(cè)。結(jié)果表明,高氧組小鼠鼠肺14天、21天NF-κB p65表達(dá)顯著增高,加入FGF-10可明顯減低體外培養(yǎng)小鼠肺細(xì)胞NF-κB p65的表達(dá)。提示FGF-10可反饋抑制NF-κB p65表達(dá),這為FGF-10減輕肺損傷炎癥反應(yīng)提供了理論支持。研究?jī)?nèi)容五:為進(jìn)一步探尋FGF-10在肺損傷修復(fù)中的作用和其中可能的機(jī)制,我們構(gòu)建了pCDH-FGF10重組表達(dá)載體,使用菌液作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增,鑒定FGF-10表達(dá),結(jié)果可見(jiàn)特異條帶出現(xiàn)在大約600bp處,與fgf10的堿基數(shù)吻合。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行基因測(cè)序,結(jié)測(cè)序結(jié)果與fgf10序列完全匹配,證明構(gòu)建pCDHFGF10重組表達(dá)載體成功。Western Blot檢測(cè)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,結(jié)果顯示可體外表達(dá)。這為下一步實(shí)驗(yàn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。總之,本研究證實(shí)了我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)想,外源性補(bǔ)充FGF-10可對(duì)新生小鼠BPD模型的肺損傷起到修復(fù)作用,并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行了初步探討,這為探尋BPD新的并且有效的臨床治療手段提供了思路。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R722.6;R-332
【圖文】：

海軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文三、結(jié)果（一）小鼠一般情況在模型建立過(guò)程中，高氧組小鼠未出現(xiàn)高氧不耐受而死亡情況，空氣組小鼠亦無(wú)死亡。生后 7 天時(shí)，高氧組小鼠精神反應(yīng)、活動(dòng)、進(jìn)食、呼吸等情況與空氣組無(wú)明顯差異。至生后 14 天時(shí)，高氧組小鼠活動(dòng)減少，反應(yīng)狀況變差，離氧一段時(shí)間后精神煩躁。毛發(fā)粗糙、蓬亂、光澤差。生后 21 天時(shí)，高氧組小鼠體重增長(zhǎng)欠佳，體型偏小，毛發(fā)不光順，一旦離氧便有煩躁、呼吸急促、口唇及趾端發(fā)紫等缺氧表現(xiàn)。而空氣組小鼠體重增長(zhǎng)佳，毛發(fā)光澤、反應(yīng)情況均良好。兩組小鼠入組時(shí)體重?zé)o差異，但至生后 21 天時(shí)，兩組小鼠體重 (n=22)分別為 16.7±1.44g 和 22.2±1.81g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-11.187，P<0.001)（圖 1）。

21天的鼠肺，通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均光密度，結(jié)果顯示，兩組小鼠鼠肺中FGF-10表達(dá)在4天、7天、14天無(wú)明顯差異。而21天時(shí)，高氧組小鼠鼠肺中FGF-10表達(dá)較空氣組小鼠明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。進(jìn)而，我們采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)相應(yīng)日齡的兩組小鼠鼠肺FGF-10 mRNA及FGF-10表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示FGF-10 mRNA水平，兩組小鼠4天、7天、14天無(wú)明顯差異，而21天時(shí)高氧組小鼠較空氣組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著日齡增加，高氧組小鼠FGF-10表達(dá)逐漸減少，而空氣組小鼠FGF-10表達(dá)無(wú)明顯變化（圖2）。

天、14天無(wú)明顯差異，而21天時(shí)高氧組小鼠較空氣組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著日齡增加，高氧組小鼠FGF-10表達(dá)逐漸減少，而空氣組小鼠FGF-10表達(dá)無(wú)明顯變化（圖2）。

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本文編號(hào)：2744590