發(fā)布時間：2020-07-07 03:36

【摘要】：支氣管肺發(fā)育不良(BPD)是嬰兒最常見的慢性肺疾病(CLD)之一,經(jīng)典型BPD首先作為因氧氣和機械通氣導(dǎo)致的肺損傷由Northway團隊于1967年描述并定義的。盡管近幾十年來主要治療措施取得進展,BPD發(fā)病率仍較高。然而預(yù)防和治療BPD的方式仍非常有限,藥物治療主要是減輕癥狀,而效果不理想,因此重新啟動肺泡生長和誘導(dǎo)肺泡結(jié)構(gòu)發(fā)育的治療策略將成為治療目標。FGF-10是一種旁分泌細胞因子,主要表達于間充質(zhì)細胞,調(diào)節(jié)間質(zhì)-上皮相互作用信號,它參與多種組織器官的發(fā)育和損傷修復(fù)過程,并具有重要作用,尤其在肺發(fā)育和損傷修復(fù)過程中作用顯著。本項研究首先建立高氧誘導(dǎo)的新生小鼠BPD模型,之后對BPD模型小鼠肺中FGF-10的表達進行檢測,再將BPD模型小鼠肺細胞進行體外培養(yǎng),進一步檢測FGF-10是否對細胞炎性因子、間充質(zhì)干細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞有影響。初步探討FGF-10與NF-κB相互作用關(guān)系。構(gòu)建pCDHFGF10載體,并檢測其表達,為下一步研究FGF-10預(yù)防和治療BPD提供實驗依據(jù)。本研究分為以下五部分:研究內(nèi)容一:將80只2日齡昆明小鼠平均隨機分配到箱內(nèi)氧濃度維持60%-70%的高氧組和空氣組。高氧組小鼠置于底部鋪有鈉石灰以吸附CO_2的自制密閉養(yǎng)殖箱,維持CO_2濃度0.5%。兩組均乳母鼠共處以哺乳新生小鼠,將兩組母鼠每日交換以防母鼠高氧不耐受而死亡。建立新生小鼠BPD模型。生后21天時,高氧組小鼠體型偏小,體重增長不理想;毛發(fā)不光順,離氧后精神煩躁,出現(xiàn)呼吸困難及口唇、趾端紫紺表現(xiàn)。高氧組小鼠肺HE染色可見其結(jié)構(gòu)逐漸出現(xiàn)BPD樣表現(xiàn),早期可見肺泡間隔增厚、出血及炎性細胞浸潤,后期可見肺泡數(shù)量減少、肺泡融合形成及炎性不張,證明高氧誘導(dǎo)的新生小鼠BPD模型建立成功。研究內(nèi)容二:為研究FGF-10在BPD中的作用,我們首先檢測了FGF-10在新生小鼠BPD模型中的表達情況。我們使用免疫組化法分別檢測4天、7天、14天、21天的高氧組和空氣組小鼠鼠肺,結(jié)果顯示,生后21天時,高氧組小鼠鼠肺中FGF-10表達明顯減少。進而,我們將相應(yīng)日齡的兩組小鼠鼠肺進行RT-PCR和Western Blot檢測。生后21天時高氧組小鼠FGF-10 mRNA水平明顯減少。Western Blot結(jié)果顯示,高氧組小鼠FGF-10表達隨著日齡增加而逐漸減少。這表明高氧誘導(dǎo)的BPD模型小鼠肺FGF-10 mRNA水平和蛋白水平減低。研究內(nèi)容三:為檢測外源性補充FGF-10因子是否對BPD有改善作用,我們將空氣組與高氧組小鼠鼠肺分為normoxia、normoxia+FGF-10、hyperoxia、hyperoxia+FGF-10四組進行體外培養(yǎng)。進而使用ELISA法檢測各組上清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-2、TGF-β等6個炎性細胞因子的表達,檢測發(fā)現(xiàn)hyperoxia組,IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MIP-2、TGF-β均明顯升高,而加入FGF-10可逆轉(zhuǎn)IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-2、TNF-α的升高,提示FGF-10可減輕體外培養(yǎng)肺細胞炎癥反應(yīng)。為檢測FGF-10能否對外培養(yǎng)肺間充質(zhì)干細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞具有促進生長的作用,我們利用流式細胞術(shù)檢測CD29~+CD90~+雙陽性與CD34~-CD105~+單陽性的細胞表面分子標志物,結(jié)果顯示,hyperoxia組CD29~+CD90~+雙陽性細胞比例最低,hyperoxia+FGF-10組雙陽性細胞比例明顯升高;肺泡Ⅱ型上皮細胞生長的作用,通過免疫熒光檢測,發(fā)現(xiàn)hyperoxia組SPC表達減少,hyperoxia+FGF-10組SP-C表達明顯增高,證明FGF-10具有促進肺間充質(zhì)干細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞生長的作用,說明FGF-10可通過此過程修復(fù)肺損傷。研究內(nèi)容四:研究報道NF-κB抑制FGF-10表達,而我們研究發(fā)現(xiàn)FGF-10可減低炎性因子表達,因此我們設(shè)想FGF-10是否反饋抑制NF-κB表達。高氧組小鼠鼠肺NF-κB p65的表達通過免疫組化來檢測,加入FGF-10對體外培養(yǎng)小鼠肺細胞NF-κB p65的表達情況通過Western Blot來檢測。結(jié)果表明,高氧組小鼠鼠肺14天、21天NF-κB p65表達顯著增高,加入FGF-10可明顯減低體外培養(yǎng)小鼠肺細胞NF-κB p65的表達。提示FGF-10可反饋抑制NF-κB p65表達,這為FGF-10減輕肺損傷炎癥反應(yīng)提供了理論支持。研究內(nèi)容五:為進一步探尋FGF-10在肺損傷修復(fù)中的作用和其中可能的機制,我們構(gòu)建了pCDH-FGF10重組表達載體,使用菌液作為PCR模板進行擴增,鑒定FGF-10表達,結(jié)果可見特異條帶出現(xiàn)在大約600bp處,與fgf10的堿基數(shù)吻合。挑取陽性克隆進行基因測序,結(jié)測序結(jié)果與fgf10序列完全匹配,證明構(gòu)建pCDHFGF10重組表達載體成功。Western Blot檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞,結(jié)果顯示可體外表達。這為下一步實驗奠定了實驗基礎(chǔ)�？傊�,本研究證實了我們的實驗設(shè)想,外源性補充FGF-10可對新生小鼠BPD模型的肺損傷起到修復(fù)作用,并對其可能的機制進行了初步探討,這為探尋BPD新的并且有效的臨床治療手段提供了思路。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R722.6;R-332
【圖文】：

海軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文三、結(jié)果（一）小鼠一般情況在模型建立過程中，高氧組小鼠未出現(xiàn)高氧不耐受而死亡情況，空氣組小鼠亦無死亡。生后 7 天時，高氧組小鼠精神反應(yīng)、活動、進食、呼吸等情況與空氣組無明顯差異。至生后 14 天時，高氧組小鼠活動減少，反應(yīng)狀況變差，離氧一段時間后精神煩躁。毛發(fā)粗糙、蓬亂、光澤差。生后 21 天時，高氧組小鼠體重增長欠佳，體型偏小，毛發(fā)不光順，一旦離氧便有煩躁、呼吸急促、口唇及趾端發(fā)紫等缺氧表現(xiàn)。而空氣組小鼠體重增長佳，毛發(fā)光澤、反應(yīng)情況均良好。兩組小鼠入組時體重?zé)o差異，但至生后 21 天時，兩組小鼠體重 (n=22)分別為 16.7±1.44g 和 22.2±1.81g，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-11.187，P<0.001)（圖 1）。

21天的鼠肺，通過Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均光密度，結(jié)果顯示，兩組小鼠鼠肺中FGF-10表達在4天、7天、14天無明顯差異。而21天時，高氧組小鼠鼠肺中FGF-10表達較空氣組小鼠明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。進而，我們采用實時定量PCR和Western Blot方法檢測相應(yīng)日齡的兩組小鼠鼠肺FGF-10 mRNA及FGF-10表達情況。實時定量PCR檢測結(jié)果顯示FGF-10 mRNA水平，兩組小鼠4天、7天、14天無明顯差異，而21天時高氧組小鼠較空氣組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著日齡增加，高氧組小鼠FGF-10表達逐漸減少，而空氣組小鼠FGF-10表達無明顯變化（圖2）。

天、14天無明顯差異，而21天時高氧組小鼠較空氣組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著日齡增加，高氧組小鼠FGF-10表達逐漸減少，而空氣組小鼠FGF-10表達無明顯變化（圖2）。

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