【摘要】：抗病毒天然免疫系統(tǒng)是生物長久進化選擇的結果,是抵抗病毒感染的第一道防線。I型干擾素(Type Ⅰ interferons,IFN-I)是脊椎動物對抗急性病毒感染的重要效應分子,分為IFN-α和IFN-β兩大類。IFN-I通過JAK-STAT信號通路激活上千個干擾素誘導基因(IFN-stimualted genes,ISGs)的轉錄。宿主產(chǎn)生的ISGs可以通過抑制病毒穿入、擾亂病毒復制以及降解病毒蛋白和核酸等方式來限制病毒生命周期,從而抵抗單股正鏈RNA((+)ssRNA)病毒、單股負鏈RNA((-)ssRNA)病毒、雙鏈RNA(dsRNA)病毒和DNA病毒的感染。干擾素應答的失調可能導致抗病毒免疫功能缺陷或自身免疫性疾病。因此,IFN-I應答要受到緊密調控,其動態(tài)平衡對于機體內環(huán)境穩(wěn)定與抵御外部病原體入侵尤為重要。IFN-I信號通路能通過自分泌環(huán)(Autocrine loop)維持自我穩(wěn)態(tài),而且IFN-I信號通路組成分子IFNAR、JAK1、TYK2、STAT1、STAT2和IRF9廣泛性地表達在多種細胞中。由于STAT1和IRF9在天然免疫細胞中的組成性本底表達比較高,天然免疫細胞對低劑量的IFN-I就能夠快速做出應答�？共《久庖叩男肿雍驼{控因子受到轉錄水平、翻譯水平以及翻譯后水平的調控。機體通過翻譯水平調控某些特定基因的表達來迅速適應外界環(huán)境應激,這樣的調控模式也是宿主抗病毒天然免疫應答調控的理想型模式。宿主通過操控自身的翻譯機器來產(chǎn)生更多的抗病毒效應分子。因此,通過選擇性翻譯調控蛋白表達對于防御病毒感染也是至關重要的。但是,目前對于抗病毒天然免疫在翻譯水平調控的研究報道不多,需要更深入地研究。近年來,隨著眾多表觀酶和表觀修飾方式的發(fā)現(xiàn)和研究,免疫系統(tǒng)分化發(fā)育與功能的表觀調控成為生物醫(yī)學的一個前沿熱點課題。目前對于天然免疫應答的表觀調控的研究尚剛剛起步,有許多未知領域值得探索。在本課題研究中,我們發(fā)現(xiàn)m6A的讀碼器YTHDF3通過促進轉錄抑制因子FOX03蛋白表達,從而負向調控I型干擾素介導的抗病毒天然免疫應答。為了研究YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3是否參與抗病毒天然免疫應答,我們通過siRNA干擾和CRISPR-Cas9敲除巨噬細胞中YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的表達,我們發(fā)現(xiàn)只有干擾YTHDF3和敲除YTHDF3會顯著抑制VSV復制。與此同時,我們發(fā)現(xiàn)YTHDF3缺失可以抑制EMCV和HSV-1復制,表明YTHDF3具有廣譜的抗病毒作用,而且病毒感染能抑制YTHDF3的表達,表明YTHDF3可能是一個重要的抗病毒天然免疫反饋調節(jié)分子。YTHDF3缺失后,本底ISGs選擇性地表達升高;但是當I型干擾素受體IFNAR1缺失后,我們發(fā)現(xiàn)干擾YTHDF3和雙敲YTHDF3-/-Ifnar1-/-與對照組相比,ISGs的表達和抗病毒能力均沒有差異,表明YTHDF3負向調控抗病毒天然免疫依賴于IFNAR1。體內實驗表明,YTHDF3-/-小鼠相對于同窩對照野生型小鼠更能抵抗VSV感染。為了研究YTHDF3負向調控抗病毒天然免疫的分子機制,我們通過增強型紫外交聯(lián)免疫沉淀聯(lián)合高通量測序(eCLIP-seq)實驗,找到YTHDF3的靶向RNAs。通過生物信息分析,我們發(fā)現(xiàn)YTHDF3能夠結合FOX03(Forkhead boxprotein 03)mRNA的翻譯起始區(qū)域。FOX03是轉錄抑制分子,能夠特異地負向調控抗病毒效應分子的本底表達。YTHDF3缺失能降低FOX03蛋白表達,而且只有全長的YTHDF3蛋白才能結合FOX03 mRNA 和其他靶向 RNAs。YTH(YT521-B homology)結構域、缺失 YTH 結構域的突變體或缺失脯氨酸/甘氨酸/天冬氨酸富集結構域的突變體對于FOX03 mRNA的結合能力都顯著下降,而且結合RNA骨架的K422和R533以及形成的疏水口袋特異識別m6A的W438和W492突變成丙氨酸后,同樣失去了結合靶向FOX03的能力。為了研究YTHDF3的分子功能,我們通過質譜鑒定了 YTHDF3相互作用蛋白組,發(fā)現(xiàn)YTHDF3結合蛋白翻譯起始因子和多種RNA結合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)。通過分析YTHDF3的相互作用蛋白組,我們推測YTHDF3在翻譯水平調控了 IFN-I介導的抗病毒免疫應答,并且我們發(fā)現(xiàn)PABP1和eIF4G2能夠與YTHDF3協(xié)同調控FOX03的翻譯。最后,通過在YTHDF3缺失細胞中回補FOX03的表達,發(fā)現(xiàn)其可以逆轉缺失YTHDF3抑制病毒復制的作用,從而證明YTHDF3與PABP1和eIF4G2協(xié)同促進FOXO3的蛋白翻譯,從而負向調控Ⅰ型干擾素介導的抗病毒天然免疫應答。我們的研究證實YTHDF3通過促進FOXO3蛋白表達來負向調控I型干擾素抗病毒天然免疫應答。我們提出了一個抗病毒天然免疫應答翻譯調控的新模式。YTHDF3不僅可以成為用于增強ISGs本底表達來抵抗病毒感染的一個潛在靶點,還可能參與腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展,也可能會作為腫瘤和自身免疫性疾病防治的潛在靶點。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392
【圖文】：

圖２．３邋ＹＴＨＤＦ３促進ＶＳＶ復制逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．３邋ＹＴＨＤＦ３邋ｐｒｏｍｏｔｅｓ邋ＶＳＶ邋ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ逡逑

用ＥＭＣＶ邋（單股正鏈ＲＮＡ病毒，（（＋）ｓｓＲＮＡ））和ＨＳＶ－１邋（ＤＮＡ病毒）感染１２ｈ，Ｑ－逡逑ＰＣＲ檢測ＥＭＣＶ的ＲＮＡ和ＨＳＶ－１的ｇＤＮＡ，我們發(fā)現(xiàn)干擾ＹＴＨＤＦ３后的腹腔巨噬細胞逡逑能夠抑制ＥＭＣＶ和ＨＳＶ－１的復制（圖２．４Ａ）。我們又在ＹＴＨＤＦ３缺失的ＲＡＷ２６４．７細逡逑胞中，同樣感染ＥＭＣＶ和ＨＳＶ－１，結果和干擾ＹＴＨＤＦ３—致（圖２．４Ｂ），都能夠有效逡逑地抑制病毒的復制。根據(jù)上述結果，我們可以得出ＹＴＨＤＦ３缺失的細胞能夠有效抵逡逑抗ＲＮ邋Ａ病毒和ＤＮＡ病毒的感染，證實ＹＴＨＤＦ３具有廣譜的促進病毒復制能力。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑□邋ｓｉＣｔｒｌ邐□邋ＹＴＨＤＦ３ｔ，＋邐□邋ｓｉＣｔｒｌ邐□邋ＹＴＨＤＦ３＋／４逡逑■邋ｓｉＹＴＨＤＦ３邐■邋ＹＴＨＤＦ３＇－邐？邐■邋ｓｉＹＴＨＤＦ３邐￣邐■邋ＹＴＨＤＦ３—＇—逡逑孓邋１０邐＾邐＃rP保埃埃?邐共＂0邋１５邋■邐４0１邐

結果表明小鼠脾臟中的ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ４＿Ｔ細胞、ＣＤｒＴ細胞、ＮＫ細胞、逡逑樹突狀細胞和巨噬細胞的組成百分比沒有改變（圖２．１０）。但有趣的是，ＹＴＨＤＦ３＋逡逑小鼠脾臟相對于野生型小鼠表現(xiàn)明顯肥大（圖２．１１邋），出現(xiàn)脾腫大癥狀（Ｓｐｌｅｎｏｍｅｇａｌｙ邋）。逡逑我們推測其原因可能脾臟中某類細胞數(shù)量增多，另外ＹＴＨＤＦ３＋基因缺失引起的逡逑ＩＳＧｓ表達升高，包括一些炎癥性基因的高表達，也可能引起脾臟進行性慢性炎癥，逡逑使得小鼠脾臟變大。對于脾腫大這一現(xiàn)象，我們需要進一步深入研究。逡逑ＡＢＣ逡逑Ｂ邋ｃｅｌｌｓ邐ＣＤ４＋邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ邐ＣＤ８＋邋Ｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑１１邐１＊１，，＜：邐２８５％邐２＾９％邐＂邋＊［；邐＾｜－１邐１３．８％逡逑４＾５％邐１邋ｊ］逡逑＾邐？？鳙，邐ｗ邋”ａ邋？，邐？．邋＊？邋？，邋ｗ＊邋＊，》？邐？？邋？

【二級參考文獻】

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本文編號：2743411