【摘要】：肝細(xì)胞受損并累積可引發(fā)肝臟疾病,肝細(xì)胞受損程度和肝功能的實(shí)時檢測評價,對于預(yù)防、早期診斷和治療肝臟疾病具有重要意義。甘膽酸是膽汁酸的主要成分之一,由膽固醇與肝內(nèi)的甘氨酸結(jié)合而成,研究指出,甘膽酸經(jīng)腎臟排泄明顯,與肝膽疾病的嚴(yán)重程度相關(guān),是評價肝臟功能的一項很重要的指標(biāo)。因此,檢測尿液中的甘膽酸對臨床檢測有一定指導(dǎo)價值,且臨床上檢測甘膽酸多為取靜脈血,對于小兒患者和不便于取靜脈血的患者,檢測其尿液中的甘膽酸有著其便利性與對疾病診斷的研究意義。本研究首先通過細(xì)胞融合獲得甘膽酸(GCA)的單克隆抗體,同時建立基于甘膽酸單克隆抗體的表面等離子共振生物傳感器、免疫層析試紙條和化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。具體的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括以下幾個方面:1、甘膽酸單克隆抗體的制備及表征本實(shí)驗(yàn)采用活潑脂法合成的免疫抗原GCA-BSA并免疫雌性Balb/C小鼠,經(jīng)過細(xì)胞融合,獲得能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株GCA-BSA-5H2。采用腹水誘生法獲得大量單克隆抗體,先通過辛酸-硫酸銨法初步純化,再通過Protein G柱純化和單克隆抗體亞型分型試劑盒鑒定其亞型為IgG1型。2、建立基于甘膽酸單克隆抗體的表面等離子共振生物傳感器本實(shí)驗(yàn)將不同稀釋度的甘膽酸單克隆抗體注入富集有包被抗原GCA-OVA的CM5芯片,測得單克隆抗體與甘膽酸之間的親和力為Kd=1.983*10-9M。建立基于甘膽酸單克隆抗體的表面等離子共振生物傳感器的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。IC50為39.8ng/mL,線性范圍是13.3-119.4ng/mL。除了與牛黃膽酸(TCA)的交叉反應(yīng)率達(dá)40%,其他的膽酸結(jié)構(gòu)類似物與對應(yīng)抗體的交叉反應(yīng)率均小于10%。為了驗(yàn)證基于單克隆抗體的表面等離子共振生物傳感器,利用間接競爭ELISA與其進(jìn)行比較,兩者具有很強(qiáng)的相關(guān)性(R2=0.9983)。3、建立基于甘膽酸單克隆抗體的免疫層析試紙條本實(shí)驗(yàn)制備了平均粒徑約為115.45±10.53nm聚苯胺-金納米粒子,以聚苯胺-金納米粒子為標(biāo)記物制備了聚苯胺-金納米試免疫層析紙條,對基于甘膽酸單克隆抗體的免疫層析試紙條進(jìn)行方法學(xué)考察,研究結(jié)果表明,該試紙條特異性好,重復(fù)性高,性能穩(wěn)定,可將其應(yīng)用于尿液樣品中甘膽酸的定性檢測。4、基于甘膽酸單克隆抗體的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法將聚苯胺-金納米粒子(PPAuNP)標(biāo)記IgG-HRP,確定CLIA方法的最優(yōu)工作條件為包被時間為1.5h,封閉為0.75h,抗原抗體反應(yīng)時間為0.75h,標(biāo)記的IgG-HRP與抗體反應(yīng)時間為0.75h,發(fā)光底物作用時間為4min。利用GCA建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,所建立方法的檢測范圍(IC15-IC85)為 161.99-61929.99 ng/mL,IC5G值為 274.82,最低檢測限(LOD,IC10)為56.26 ng/mL。并對334份人體尿液樣本進(jìn)行檢測,慢性肝炎,肝硬化和肝腫瘤組尿液樣品中的GCA濃度分別是健康對照組的6.3倍,9.1倍和10.1倍(P0.001),陽性率分別為86.4%、78.9%、63.7%。綜上所述,本研究制備獲得可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株GCA-BSA-5H2。以甘膽酸的單克隆抗體為基礎(chǔ)分別建立了表面等離子共振生物傳感器、免疫層析分析方法和化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。通過對尿液中甘膽酸的定性檢查,可在在早期篩查中快速判斷病變標(biāo)志物(甘膽酸)是否異常,而甘膽酸的定量檢測結(jié)果表明,甘膽酸在不同肝臟疾病中的含量存在明顯的差異,說明甘膽酸水平的高低與肝臟病理損害程度密切相關(guān)。通過與臨床指標(biāo)AST、ALT、AFP相比較,甘膽酸在能夠更好的反映潛在的慢性肝損傷,在判斷肝硬化與肝腫瘤方面優(yōu)于AST、ALT、AFP指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中所研究的免疫學(xué)分析方法都可以對甘膽酸進(jìn)行有效的檢測,可實(shí)現(xiàn)對肝功能的監(jiān)控。
【學(xué)位授予單位】：廣東工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R392-33;O657.3;TQ464
【圖文】：

甘膽酸（Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＧＣＡ）化學(xué)式為Ｃ２６Ｈ？Ｎ0６，分子量為：４６５．６２，微溶逡逑于水，無氣味，為白色結(jié)晶粉末，熔點(diǎn)為１２８°Ｃ。其中文別名為Ｎ－（３，７，１２－三羥基－２４－逡逑羰基膽烷－２４－基）－甘氨酸。它的分子結(jié)構(gòu)式如圖１－１所示。逡逑？Ｈ六逡逑Ｖ逡逑十0丫ＮＨ逡逑ＨＯ、、、０Ｈ逡逑Ｈ逡逑圖１－１甘膽酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．１．２甘膽酸的臨床意義逡逑在肝細(xì)胞中，甘膽酸是由甘氨酸和膽酸所形成的結(jié)合膽汁酸，甘膽酸為膽酸的主逡逑要成分之一，甘膽酸以蛋白結(jié)合的形成存在于血清中［Ｍ１。在正常情況下，甘膽酸由肝逡逑細(xì)胞合成分泌而成，經(jīng)過毛細(xì)膽管、膽管排入膽襄，再通過膽汁回流到十二指腸中，逡逑協(xié)助食物的消化。最后，９５％的甘膽酸會回到腸末端被重新吸收，經(jīng)門靜脈回到肝臟，逡逑此過程被稱為腸－肝循環(huán)（圖１－２）邐由此可知，若門靜脈重吸收的甘膽酸可以被肝逡逑臟高效的回收，則再次進(jìn)入體循環(huán)的甘膽酸不達(dá)總量的百分之一，故而血液中甘膽酸逡逑的含量較低，可當(dāng)肝臟受到損傷之后，經(jīng)門靜脈重吸收的甘膽酸則不能有效的被肝細(xì)逡逑胞所吸收

甘膽酸（Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，ＧＣＡ）化學(xué)式為Ｃ２６Ｈ？Ｎ0６，分子量為：４６５．６２，微溶逡逑于水，無氣味，為白色結(jié)晶粉末，熔點(diǎn)為１２８°Ｃ。其中文別名為Ｎ－（３，７，１２－三羥基－２４－逡逑羰基膽烷－２４－基）－甘氨酸。它的分子結(jié)構(gòu)式如圖１－１所示。逡逑？Ｈ六逡逑Ｖ逡逑十0丫ＮＨ逡逑ＨＯ、、、０Ｈ逡逑Ｈ逡逑圖１－１甘膽酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．１．２甘膽酸的臨床意義逡逑在肝細(xì)胞中，甘膽酸是由甘氨酸和膽酸所形成的結(jié)合膽汁酸，甘膽酸為膽酸的主逡逑要成分之一，甘膽酸以蛋白結(jié)合的形成存在于血清中［Ｍ１。在正常情況下，甘膽酸由肝逡逑細(xì)胞合成分泌而成，經(jīng)過毛細(xì)膽管、膽管排入膽襄，再通過膽汁回流到十二指腸中，逡逑協(xié)助食物的消化。最后，９５％的甘膽酸會回到腸末端被重新吸收，經(jīng)門靜脈回到肝臟，逡逑此過程被稱為腸－肝循環(huán)（圖１－２）邐由此可知，若門靜脈重吸收的甘膽酸可以被肝逡逑臟高效的回收，則再次進(jìn)入體循環(huán)的甘膽酸不達(dá)總量的百分之一，故而血液中甘膽酸逡逑的含量較低，可當(dāng)肝臟受到損傷之后，經(jīng)門靜脈重吸收的甘膽酸則不能有效的被肝細(xì)逡逑胞所吸收

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本文編號：2739772