【摘要】：背景:鐵死亡(Ferroptosis)是鐵離子依賴性的,非典型的細(xì)胞死亡形式,其特征在于脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物和活性氧的積累,近年來的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),鐵死亡與腦缺血的發(fā)生有關(guān),然而,其發(fā)生鐵死亡的機(jī)制尚不清楚,需要進(jìn)一步研究。鐵廣泛存在于腦組織,是腦的重要成分,腦缺血時(shí)鐵和鐵代謝相關(guān)蛋白發(fā)生改變,導(dǎo)致腦組織鐵含量升高及神經(jīng)元鐵沉積,引起神經(jīng)元損傷過量自由基的產(chǎn)物通過侵襲脂類、DNA和蛋白質(zhì),導(dǎo)致細(xì)胞嚴(yán)重的氧化損傷和氧化應(yīng)激。丹參酮ⅡA能在腦缺血模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,但是丹參酮ⅡA能否通過調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)而抑制腦缺血中鐵死亡的發(fā)生尚需進(jìn)一步研究。所以探討腦缺血模型中丹參酮ⅡA抑制鐵死亡發(fā)生的機(jī)制,可為腦缺血的臨床治療進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。目的:探索丹參酮ⅡA在腦缺血模型中抑制鐵死亡的機(jī)制。方法:首先進(jìn)行小鼠海馬細(xì)胞株的培養(yǎng),使用鐵死亡激活劑Erastin處理HT22細(xì)胞建立鐵死亡損傷模型和利用缺氧裝置構(gòu)建OGD模型,然后構(gòu)建大腦中動脈閉塞腦缺血的小鼠模型。通過CCK-8法和Hoechst染色檢測細(xì)胞活力后確定最佳的造模濃度;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化;超氧化物陰離子熒光探針(DHE)、BODIPY?581/591 C11檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)及脂質(zhì)過氧化(Lipid peroxidation)變化;FeRhoNox?-1探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性鐵含量;免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)4-HNE表達(dá);Western blot法檢測COX-2、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白變化。體內(nèi)模型將小鼠的大腦中動脈閉塞60分鐘,然后再灌注。術(shù)后應(yīng)用神經(jīng)功能評分和平衡木實(shí)驗(yàn)檢測小鼠神經(jīng)功能和肢體活動;采用TTC染色法檢測小鼠腦缺血體積;使用MDA試劑盒檢測腦缺血腦組織中氧化產(chǎn)物的含量;Western blot法檢測COX-2、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白變化。結(jié)果:1.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,0.5μmol/L Erastin作用HT22細(xì)胞8 h,細(xì)胞有50%的死亡,選擇此劑量和時(shí)間造模;而加入0.1μmol/L Tan ⅡA對細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用;OGD模型作用HT22細(xì)胞18 h再灌注10 h后細(xì)胞約有50%以上的死亡,選擇此時(shí)間造模;而加入1μmol/L Tan ⅡA對細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用;2.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和Hoechst染色結(jié)果顯示,當(dāng)0.5μmol/L Erastin作用HT22細(xì)胞8 h后,細(xì)胞變小變圓,細(xì)胞的貼壁狀態(tài)差,出現(xiàn)損傷狀態(tài),加入0.1μmol/L Tan ⅡA對細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用;OGD模型作用于HT22細(xì)胞18 h再灌注10h后,對細(xì)胞損傷的影響,加入1μmol/L Tan ⅡA對細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用;3.DHE和BODIPY?581/591 C11熒光染色結(jié)果表明,與對照組相比,Erastin組和OGD組中細(xì)胞內(nèi)ROS和lipid peroxidation顯著增高,Tan ⅡA組中細(xì)胞內(nèi)ROS和lipid peroxidation升高沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;4.FeRhoNox?-1探針染色結(jié)果表明,與對照組相比Erastin組和OGD組中細(xì)胞內(nèi)活性鐵顯著增高,Tan ⅡA組和對照組之間細(xì)胞內(nèi)活性鐵沒有顯著差異;5.免疫熒光檢測4-HNE結(jié)果顯示,與對照組相比,OGD組細(xì)胞內(nèi)4-HNE表達(dá)顯著增加,Tan ⅡA組和對照組之間細(xì)胞內(nèi)4-HNE表達(dá)沒有顯著差異;6.TTC染色結(jié)果表明,與對照組相比MCAO組小鼠腦缺血體積增大,與MCAO組相比Tan ⅡA組中小鼠腦缺血體積減小;7.神經(jīng)功能評分和平衡木實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與MCAO組相比Tan ⅡA組中小鼠神經(jīng)功能評分降低,而平衡木實(shí)驗(yàn)評分增高;8.MDA結(jié)果顯示,與對照組相比,MCAO組小鼠腦組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量增加,與MCAO組相比,Tan ⅡA組中小鼠腦組織脂質(zhì)氧化產(chǎn)物含量降低;9.Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,OGD組和MCAO組COX-2蛋白表達(dá)增多而鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白降低,但是Tan ⅡA組COX-2蛋白表達(dá)降低而鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白卻增高。結(jié)論:丹參酮ⅡA對腦缺血模型中的鐵死亡具有抑制作用,它的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài),減少細(xì)胞內(nèi)的ROS、Lipid peroxidation、活性鐵含量,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R743;R-332
【圖文】：

n對HT22的細(xì)胞毒性 μmol/L Erastin處理組；C：0.5 μmol/L Erastin處理組；5，**P＜0.01，***P＜0.001，與對照組（0 μmol/L）比s the cytotoxicity of Erastin on HT2205 μmol/L Erastin treatment group; C: 0.5 μmol/L Erastin ent group; *P<0.05, **P<0.01, ***P <0.001, compared wstin損傷HT22細(xì)胞存活率的影響不同濃度的Tan IIA對HT22細(xì)胞存活率的影響。明顯的保護(hù)作用，與對照組相比，細(xì)胞存活率（表明Tan IIA在該濃度范圍內(nèi)顯著抑制HT22細(xì)胞

對HT22的細(xì)胞毒性mol/L Tan IIA預(yù)處理后加入Erastin 0.5 μmol/L；C： μmol/L；D：1 μmol/L Tan IIA預(yù)處理后加入Erasti**P＜0.01he cytotoxicity of Tan IIA on HT22 μmol/L Tan IIA pre-treated with Erastin 0.5 μmol/L; Ctin 0.5 μmol/L; D: 1 μmol/L Tan IIA pre- After treatmpared with the control group (0 μmol/L): **P<0.01察和Hoechst染色確定Tan IIA對HT22細(xì)胞的觀察細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)0.5 μmol/ L Erastin在HT22變化。折射率顯著降低，很多細(xì)胞懸浮。與

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本文編號：2739737