發(fā)布時(shí)間：2020-07-03 08:32

【摘要】：抗生素耐藥性是威脅人類(lèi)健康安全的主要問(wèn)題之一。大多數(shù)導(dǎo)致慢性感染并且難以治愈的致病菌本身并不具有抗生素耐藥性。大量研究表明,具有藥物耐受性的持留菌是造成病情反復(fù)和藥物治療能力下降的重要原因。持留菌是在抗生素致死劑量下仍可以存活的表型突變體,可以保持低代謝活性狀態(tài)并在壓力條件移除后恢復(fù)正常生長(zhǎng),但它們并不改變細(xì)菌群體對(duì)于藥物的敏感性。持留現(xiàn)象最先在青霉素處理的金黃色葡萄球菌中被發(fā)現(xiàn),隨后,人們逐漸發(fā)現(xiàn)持留是存在于細(xì)菌群落中的普遍現(xiàn)象,持留菌造成細(xì)菌感染慢性疾病的治療難題。持留菌對(duì)于抗生素產(chǎn)生的藥物耐受是暫時(shí)性非遺傳表型,多種難治愈慢性感染疾病均與細(xì)菌持留有關(guān),包括結(jié)核病。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病,結(jié)核菌可能侵入人體以肺臟為代表的全身各種器官。隨著研究的深入,結(jié)核分枝桿菌的持留相關(guān)基因被相繼發(fā)現(xiàn),這些基因大多和細(xì)菌的新陳代謝和表達(dá)調(diào)控有關(guān)。酮、醛和醇是原核生物和真核生物所必需的物質(zhì),催化它們相互轉(zhuǎn)化的酶可主要分為三大類(lèi):NAD(P)依賴(lài)性醇脫氫酶(ADH),非NAD(P)依賴(lài)性醇脫氫酶和催化醇的不可逆氧化反應(yīng)的FAD依賴(lài)性醇氧化酶。微生物的ADHs可以進(jìn)一步分為三個(gè)主要的亞類(lèi),它們的廣譜底物包括脂肪醇、芳香醇、酮和醛。在ADH催化醇轉(zhuǎn)化為醛的過(guò)程中,NAD~+會(huì)被還原為NADH。目前,關(guān)于細(xì)菌ADHs的研究主要集中在代謝,乙醇耐受,亞硝化應(yīng)激和毒力等方面,尚未有報(bào)道在結(jié)核分枝桿菌持留形成中的作用。通過(guò)結(jié)核分枝桿菌基因數(shù)據(jù)庫(kù),結(jié)核分枝桿菌基因組中編碼了二十種假定的醇脫氫酶。通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料,我們發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌醇脫氫酶基因adhA在細(xì)菌非復(fù)制階段、低酸壓力和饑餓狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄水平有著明顯的改變,并且有報(bào)道稱(chēng)它與結(jié)核分枝桿菌生物膜形成有關(guān)。因此我們猜想adhA很可能參與了分枝桿菌持留菌的形成。我們利用結(jié)核分枝桿菌的模式菌株恥垢分枝桿菌M.smegmatis對(duì)醇脫氫酶adhA在持留菌形成中的作用進(jìn)行了初步研究。我們?cè)趷u垢分枝桿菌中敲除了結(jié)核分枝桿菌adhA的同源基因MSMEG_3615,發(fā)現(xiàn)在高濃度抗生素處理下,adhA缺失的恥垢分枝桿菌突變菌的存活率明顯降低且并不改變細(xì)菌群落的抗生素藥物敏感性,這表明adhA基因?qū)u垢分枝桿菌持留菌的形成有重要作用。為研究這一現(xiàn)象的機(jī)制和醇脫氫酶的具體功能,我們首先進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ΔadhA突變體的形態(tài)發(fā)生了明顯變化,單菌落褶皺增多且更加干燥,尼羅紅染色熒光量上升;細(xì)菌長(zhǎng)度變短,疏水指數(shù)和膜電位降低;在SDS,聯(lián)氨,雙氧水壓力下存活率下降;胞內(nèi)ATP含量上升,NADH含量下降而NAD~+含量不變,造成NAD~+/NADH比率上升;通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)adhA缺失后,其他持留相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平有明顯升高。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在THP-1分化的巨噬細(xì)胞中,ΔadhA突變體的胞內(nèi)存活率明顯降低,且改變了宿主細(xì)胞因子的產(chǎn)生,但并未觀察到宿主細(xì)胞壞死和凋亡的變化。綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)醇脫氫酶基因adhA可以增加恥垢分枝桿菌持留菌的形成,這一作用可能是通過(guò)改變細(xì)菌細(xì)胞壁形態(tài)和調(diào)節(jié)細(xì)菌能量代謝達(dá)到的。這是第一次發(fā)現(xiàn)醇脫氫酶在細(xì)菌持留中的重要作用,可以對(duì)分枝桿菌持留菌形成提供參考。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R378.911
【圖文】：

-1 耐藥、耐受和持留細(xì)菌的抗生素殺菌曲線(xiàn)。 1-1 Antibiotic killing kinetics of resistant, tolerant and persister cells.結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病菌。2014 年，世界衛(wèi)生大會(huì)批準(zhǔn)了結(jié)核病戰(zhàn)略”，該戰(zhàn)略的主旨是終結(jié)全球結(jié)核病流行，其目標(biāo)是

8mM 雙氧水處理后恥垢分枝桿菌的存活率。 **P < 0.01, ***P < 0.001。 Survival rate of M. smegmatis upon exposure to 8mM H2O2. **P < 0.01, *** 敲除醇脫氫酶基因 adhA 降低恥垢分枝桿菌在 SDS 脅迫下的存DS 是一種常用的表面活性劑，可以用來(lái)檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞壁保護(hù)酶 adhA 在酮、醇和醛之間的轉(zhuǎn)化中具有重要作用，這些物合成的基本原料。因此，我們用 SDS 來(lái)檢測(cè)醇脫氫酶 adhA保護(hù)特性。我們分別用 0.1%、0.2%和 0.3%的 SDS（m/v）處，并通過(guò)滴板實(shí)驗(yàn)獲得 CFU 計(jì)算存活率，結(jié)果如圖 4-3。根脫氫酶基因 adhA 后，恥垢分枝桿菌在 SDS 脅迫下存活能力性減弱。所以，醇脫氫酶 adhA 可以影響細(xì)胞壁的穩(wěn)定性。可能與細(xì)胞壁的合成有關(guān)。

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本文編號(hào)：2739429