【摘要】：隨著人們生活環(huán)境及飲食作息的改變,許多新型疾病開(kāi)始出現(xiàn)并嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康。在“大健康”理念及其產(chǎn)業(yè)化背景下,人們的健康意識(shí)逐漸提升,對(duì)比抗生素的使用所帶來(lái)的種種問(wèn)題,益生菌療法受到廣泛的關(guān)注。隨著益生菌療法在疾病應(yīng)用中的不斷深入研究,益生菌在新型及重大疾病防治領(lǐng)域的新功能不斷刷新著人類(lèi)的認(rèn)知。我國(guó)人口眾多,飲食文化差異顯著,導(dǎo)致人體腸道菌群多樣性及豐富度高,這為益生菌的研究提供了良好的樣本來(lái)源。乳酸菌是其中代表性的益生菌,且作為人體腸道內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群,能夠調(diào)節(jié)人體腸道菌群平衡、改善宿主健康,對(duì)預(yù)防疾病尤為重要。本研究旨在分離來(lái)源于中國(guó)健康人群腸道的乳酸菌,并從中篩選出具有抑菌活性的乳酸菌,通過(guò)模擬胃液、腸液試驗(yàn)及表面疏水性試驗(yàn)對(duì)菌株的益生性進(jìn)行初步探究,通過(guò)抗生素紙片擴(kuò)散法分析菌株的耐藥性,并分析具有潛在益生性及安全的菌株其發(fā)酵液中主要抑菌物質(zhì),以期獲得更適合我國(guó)人群腸道特點(diǎn),具有高抑菌性及優(yōu)良益生性,日后有望進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用的潛力菌株。主要研究結(jié)果如下:從10份健康成年人的糞便中分離、純化得到80株乳酸菌,根據(jù)16S rRNA基因相似性分析,確定它們分別屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、腸球菌屬(Enterococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)這5個(gè)屬中的12個(gè)種。為節(jié)約人力物力,將應(yīng)用潛力較低的腸球菌、格氏乳球菌及唾液鏈球菌,根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)化親緣關(guān)系挑選出11株代表菌株,分別為:菌株2(Lactococcus garvieae)、菌株11(Lactococcus garvieae)、菌株17(Enterococcus thailandicus)、菌株28(Enterococcus gallinarum)、菌株29(Streptococcus salivarius)、菌株30(Enterococcus faecium)、菌株32(Enterococcus gallinarum)、菌株33(Enterococcus hirae)、菌株59(Enterococcus durans)、菌株63(Enterococcus faecalis)、菌株78(Enterococcus faecium),與乳桿菌菌株1、6、8、20、60、65(Lactobacillus salivarius)、菌株9(Lactobacillus ghanensis)、菌株24(Lactobacillus paracasei),及明串珠菌屬的菌株12(Leuconostoc lactis),共20株菌進(jìn)行后續(xù)的抑菌篩選試驗(yàn)。以大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923為指示菌,通過(guò)牛津杯雙層瓊脂擴(kuò)散法對(duì)20株乳酸菌進(jìn)行抑菌性試驗(yàn),篩選出5株對(duì)兩種指示菌均有明顯抑制效果的乳酸菌,依次為菌株1(Lactobacillus salivarius)、菌株9(Lactobacillus ghanensis)、菌株12(Leuconostoc lactis)、菌株24(Lactobacillus paracasei)及菌株63(Enterococcus faecalis)。對(duì)此5株具有抑菌活性的乳酸菌進(jìn)行益生性及耐藥性研究,篩選出的3株在pH3.0的模擬胃液中具有較強(qiáng)的生存能力,在含0.3%牛膽鹽的模擬腸液中具有較高的存活率,具有一定的粘附性,無(wú)多重耐藥性的乳酸菌,分別為菌株1、菌株12及菌株24。此3株乳酸菌所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)及性質(zhì)研究表明,3株乳酸菌發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性較好,且過(guò)氧化氫均不是它們發(fā)揮抑菌活性的主要有效成分。菌株12主要抑菌成分為有機(jī)酸;菌株1及菌株24的主要抑菌成分為有機(jī)酸及蛋白類(lèi)物質(zhì)。對(duì)于發(fā)酵液中可能存在的蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì),選擇硫酸銨沉淀法、有機(jī)溶劑萃取法及雙水相萃取法對(duì)其進(jìn)行提取研究,并對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫酸銨沉淀法的提取效果不理想,推測(cè)兩株菌發(fā)酵液中存在的是小分子肽類(lèi)。有機(jī)溶劑法及雙水相法對(duì)樣品均具有較好的提取效果,且雙水相系統(tǒng)提取效果最佳,經(jīng)雙水相萃取后菌株1發(fā)酵液中粗提所得抑菌物質(zhì)比活力為260.16,較原發(fā)酵液中提高了6.41倍,菌株24發(fā)酵液中粗提所得抑菌物質(zhì)比活力為161.61,較原發(fā)酵液提高了4.35倍。兩份粗提樣品的電泳分析結(jié)果顯示菌株1及菌株24的發(fā)酵液中的確存在細(xì)菌素,同時(shí)再一次證明了雙水相系統(tǒng)對(duì)細(xì)菌素具有較好的提取效果。粗提物的抑菌譜試驗(yàn)結(jié)果表明兩株菌所產(chǎn)的細(xì)菌素均具有較廣泛的抑菌活性。綜上,本研究共篩選到3株具有高抑菌活性的益生性乳酸菌菌株,為開(kāi)發(fā)預(yù)防及治療因腸道致病菌導(dǎo)致的腸道疾病的益生菌制劑提供菌種資源和應(yīng)用基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R371
【圖文】：

.1.2 分離乳酸菌株的染色及形態(tài)特征分離得到的 80 株乳酸菌，觀(guān)察其菌落形態(tài)特征，菌落體積大小均有，形態(tài)凸起或扁平，邊整齊或不整齊，顏色為乳白色、乳黃色或灰白色。對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢觀(guān)察可得，分離得乳酸菌中既有桿菌也有球菌，排列方式為成對(duì)、短鏈或長(zhǎng)鏈排列。具體形態(tài)學(xué)特征見(jiàn)表 3-1分乳酸菌鏡檢形態(tài)如圖 3-1 所示。表 3-1 分離乳酸菌的形態(tài)特征Tab.3-1 Morphological characteristics of isolated lactic acid bacteria菌株數(shù)量 菌落形態(tài)特征 鏡檢形態(tài)6 乳白色，邊緣整齊，小而凸起的菌落 桿菌2 白色，邊緣整齊，大而凸起的菌落 桿菌30 乳白色，邊緣整齊，小而凸起菌落 球菌10 灰白色，邊緣不整齊，大而扁平的菌落 球菌7 乳黃色，邊緣整齊，小而凸起菌的落 球菌25 乳白色，邊緣整齊，大而凸起菌落 球菌

DNA marker；1： lactobacillus salivarius；2：: Leuconostoc lactis；3：LactobLactobacillus paracasei；5： Enterococcus faecium；6：Lactococcus g圖 3-2 部分乳酸菌 16S r DNA 擴(kuò)增電泳圖.3-2 Electrophoresis pattern derived from 16S r DNAamplification of lact增產(chǎn)物測(cè)定所得序列，通過(guò) NCBI BLAST，同 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已知 6.0 軟件進(jìn)行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)一步確定菌株種屬。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立確定分離得到的 80 株菌株均為乳酸菌，分acillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、腸球?qū)伲⊿treptococcus）5 個(gè)屬，共有 12 個(gè)種。其中乳酸桿菌 8 株，分為 6 個(gè)種；格氏乳球菌 27 株；乳酸明串珠菌 1 株；唾液鏈球菌 7 株。表 3-2，分離所得乳酸菌 16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖 3-3 所示發(fā)育樹(shù)，2）為乳桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，3）為腸球菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，，5）為乳球菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，乳球菌屬中分離得到的乳球菌均為格部分菌株。得到的 80 株乳酸菌中，腸球菌在其中占較大比例。國(guó)外的一些研究在腸道中會(huì)在某些情況下轉(zhuǎn)為條件致病菌，雖然我國(guó)對(duì)腸球菌作為益但世界衛(wèi)生組織（WHO）建議減少腸球菌在益生菌制劑中的使用[70

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本文編號(hào)：2739070