【摘要】：目的:原發(fā)性肝癌是我國(guó)第四位常見的惡性腫瘤及第三位的腫瘤致死病因,嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的生命與健康,由于原發(fā)性肝癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率居高不下,因此揭示疾病的發(fā)展機(jī)制對(duì)于改善原發(fā)性肝癌的預(yù)后有著重要意義。DEK蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白參與各種基本的核進(jìn)程,并且在多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)出高表達(dá)趨勢(shì),DEK基因在原發(fā)性肝癌中是否也起到了至關(guān)重要的作用目前尚無明確的研究證實(shí)。本課題擬對(duì)DEK基因在原發(fā)性肝癌中所起的作用進(jìn)行臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,以進(jìn)一步揭示DEK基因與原發(fā)性肝癌之間的關(guān)系及DEK基因的基本功能。方法:11、收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)治療的原發(fā)性肝癌患者的臨床樣本50例,采用HE染色驗(yàn)證癌組織及癌旁組織可以用來進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用Western Blot和Real-Time PCR分別檢測(cè)DEK的蛋白質(zhì)及mRNA表達(dá)水平,采用免疫熒光檢測(cè)DEK蛋白的定位情況,并與臨床病理因素進(jìn)行相關(guān)性分析。2、建立肝臟特異性DEK基因敲除小鼠模型,實(shí)驗(yàn)分DEK~(fl/fl)組、DEK~(fl/fl)/Alb-Cre組,采用HE染色檢測(cè)小鼠肝臟組織病理形態(tài);采用Western Blot、Real-Time PCR和免疫熒光分別在蛋白和mRNA水平檢測(cè)DEK是否被敲除。分別選擇出生后1周、3周、5周、7周及9周的DEK~(fl/fl)小鼠及DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠各三只稱量其體重及肝臟質(zhì)量初步分析其表型。選擇5周左右的小鼠行肝葉切除術(shù)以誘導(dǎo)肝臟增殖,分別在術(shù)前、術(shù)后4天、7天、14天、21天及28天處死小鼠,采用EDU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和TUNEL原位末端凋亡法檢測(cè)小鼠肝臟的增殖和凋亡情況。3、選擇DEK~(fl/fl)小鼠及DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠各3只取出肝臟組織進(jìn)行勻漿,將勻漿液送至深圳海一公司進(jìn)行RNA-seq測(cè)序分析。結(jié)果:1、原發(fā)性肝癌患者HE染色結(jié)果證實(shí)腫瘤組織中有癌細(xì)胞浸潤(rùn),癌旁組織中無腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)。2、原發(fā)性肝癌患者Real-Time PCR結(jié)果顯示,腫瘤組織中DEK mRNA表達(dá)量顯著高于相鄰的癌旁組織(p0.05)。3、原發(fā)性肝癌患者Western Blot結(jié)果顯示,腫瘤組織中DEK蛋白表達(dá)量顯著高于相鄰的癌旁組織。4、原發(fā)性肝癌患者免疫熒光結(jié)果顯示,DEK蛋白主要定位于細(xì)胞核中,且腫瘤組織中的DEK蛋白表達(dá)量高于相鄰的癌旁組織。5、DEK的表達(dá)與原發(fā)性肝癌患者臨床病理相關(guān)因素分析結(jié)果顯示:DEK的表達(dá)與是否發(fā)生肝硬化有關(guān)(p0.0079),同時(shí)也與腫瘤的G1/G2、G3分期有關(guān)(p0.0001)。6、建立肝臟特異性DEK基因敲除小鼠模型(1)Genotyping結(jié)果顯示DEK~(fl/fl)小鼠及DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠均含有387 bp的DEK基因條帶,而僅有DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠含有272bp的Cre基因條帶。(2)敲除效率檢測(cè)結(jié)果顯示僅有DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠肝臟組織中有520bp的Deletion陽性條帶而DEK~(fl/fl)小鼠無Deletion陽性條帶。(3)Western Blot結(jié)果顯示DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠的肝臟組織中DEK蛋白表達(dá)量顯著低于DEK~(fl/fl)小鼠,而小鼠的肺及腎臟中DEK蛋白表達(dá)量無差異。(4)Real-Time PCR結(jié)果顯示DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠的肝臟組織中DEK mRNA表達(dá)量顯著低于DEK~(fl/fl)小鼠(p0.05)。(5)免疫熒光結(jié)果顯示DEK~(fl/fl)小鼠所有肝細(xì)胞的細(xì)胞核中均出現(xiàn)DEK紅色熒光而DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠中無DEK熒光信號(hào)。7、小鼠出生后分別在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠稱量小鼠體重及肝臟質(zhì)量結(jié)果顯示,DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠與DEK~(fl/fl)小鼠相比體重及肝臟質(zhì)量均無顯著變化(P0.05)。8、肝葉切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)肝臟增殖情況結(jié)果顯示,DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠肝臟組織的增殖顯著低于DEK~(fl/fl)小鼠(p0.05),這個(gè)差異在肝葉切除術(shù)后七天達(dá)頂峰。9、肝葉切除術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)肝臟凋亡情況結(jié)果顯示,DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠肝臟組織的凋亡與DEK~(fl/fl)小鼠相比并無顯著差異(p0.05)。10、RNA-seq測(cè)序分析的結(jié)果(1)差異表達(dá)基因分析結(jié)果顯示,DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠與DEK~(fl/fl)小鼠相比共有58個(gè)差異表達(dá)基因(差異≥2倍;p0.05),其中有46個(gè)上調(diào)12個(gè)下調(diào),Col7a1是上調(diào)最為顯著的,而Nlrp6是下調(diào)最為顯著的。(2)GO分析表明共得到396個(gè)GO Term,其中有223個(gè)為生物過程(56.31%,biological process,BP),富集最為顯著的是氧化還原過程(GO:0055114)和環(huán)氧化酶P450途徑(GO:0019373);有84個(gè)為細(xì)胞組分(21.22%,cellular component,CC),富集最為顯著的是細(xì)胞投射(GO:0042995)和膠原蛋白三聚體(GO:0005581);共有89個(gè)為分子功能(22.47%,Molecular Function,MF),富集最為顯著的是氧化還原酶活性(GO:0016491)和單加氧酶活性(GO:0004497)。(3)KEGG途徑分析表明,差異基因組顯著富集的通路主要是代謝途徑,類固醇激素生物合成途徑,視黃醇代謝途徑等,其中最富集的通路是代謝途徑,共有7個(gè)上調(diào)的差異基因富集到該通路。結(jié)論:1、本實(shí)驗(yàn)證實(shí)原發(fā)性肝癌患者腫瘤組織中DEK的蛋白表達(dá)量及mRNA表達(dá)量均高于相鄰的癌旁組織,且DEK蛋白僅在細(xì)胞核中表達(dá)。2、在原發(fā)性肝癌中DEK的表達(dá)與是否發(fā)生肝硬化及腫瘤的G1/G2、G3分期有關(guān),而與性別、年齡和分化程度等無關(guān)。3、本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建肝臟特異性DEK基因敲除小鼠模型,并證實(shí)DEK基因主要影響肝臟的增殖。4、差異表達(dá)基因聚類分析發(fā)現(xiàn)共有共有58個(gè)差異表達(dá)基因,其中46個(gè)上調(diào)12個(gè)下調(diào),Col7a1是上調(diào)最為顯著的,而Nlrp6是下調(diào)最為顯著的。5、GO分析表明在生物過程中差異基因最富集GO Term是氧化還原過程,細(xì)胞組分中最富及的GO Term是細(xì)胞投射,分子功能中最富集的GO Term是氧化還原酶活性。KEGG途徑分析表明差異表達(dá)基因主要參與的途徑是代謝途徑,類固醇激素生物合成途徑,視黃醇代謝途徑。其中最富集的通路是代謝途徑,共有7個(gè)上調(diào)的差異基因富集到該通路。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R735.7;R-332

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