發(fā)布時間：2020-07-02 04:23

【摘要】：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是醫(yī)院感染中最常見的致病菌之一,由于廣泛且不合理的使用抗生素,MRSA的耐藥性問題日益嚴(yán)重。已有的研究表明,MRSA的主動外排系統(tǒng)和生物被膜的形成是導(dǎo)致其產(chǎn)生多重耐藥的主要原因。其中,主動外排系統(tǒng)和生物被膜的形成均與耐藥蛋白有關(guān)。本實驗室前期研究結(jié)果也證明,染料木素中藥單體化合物能顯著抑制MRSA蛋白的表達(dá)量,由此推測其對MRSA的抑制作用與蛋白有關(guān),但關(guān)于染料木素作用MRSA后,菌體蛋白的變化尚不清楚。因此,本文通過iTRAQ技術(shù)檢測了染料木素作用MRSA后菌體蛋白表達(dá)量的變化;并通過生物信息學(xué)分析方法,對差異顯著的蛋白在分子功能、生物學(xué)進(jìn)程、所處細(xì)胞位置以及所參與的通路等方面的差異進(jìn)行系統(tǒng)的分析,進(jìn)而探討了耐藥相關(guān)蛋白在介導(dǎo)細(xì)菌耐藥方面的作用機制。具體的研究結(jié)果如下:(1)通過iTRAQ技術(shù),檢測染料木素作用MRSA后菌體蛋白的表達(dá)差異。實驗結(jié)果顯示,樣品共檢測到1312個蛋白,與對照組相比,差異顯著蛋白共有129個,包括60個表達(dá)上調(diào)的蛋白和69個表達(dá)下調(diào)的蛋白;(2)通過qRT-PCR法,檢測了差異顯著的上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白的基因表達(dá)水平,以驗證iTRAQ檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,下調(diào)蛋白PstB和PstC中的mRNA表達(dá)水平明顯降低,其基因表達(dá)量分別下降了51.6%和52.1%(P0.01);上調(diào)蛋白SecY、Mip和RecT的mRNA的表達(dá)量顯著性增加,與對照組相比,分別增加了77.2%、87.5%和90.1%(P0.01)。基因表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平的變化趨勢完全一致,表明本研究的iTRAQ檢測結(jié)果準(zhǔn)確,可用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。(3)通過GO、KEGG和String方法,對染料木素作用MRSA后差異顯著蛋白表達(dá)的差異性進(jìn)行生物信息學(xué)分析。1)GO分析結(jié)果顯示,所檢測到的129個顯著性差異蛋白,主要參與10種生物學(xué)過程,按照基因所占比例的高低,這些差異顯著蛋白分別參與代謝(80%),細(xì)胞(65%)和單有機體(58%)等過程;主要分布在細(xì)胞(46%),細(xì)胞組分(44%),細(xì)胞膜(22%)等位置;分別執(zhí)行催化(63%),結(jié)合(44%)和轉(zhuǎn)運(10%)等功能。2)KEGG通路數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,所檢測的129個差異顯著蛋白,參與的通路主要包括四大類,分別是代謝通路、遺傳信息處理通路、環(huán)境信息處理通路和一些未知的通路。其中,代謝通路所包含的差異蛋白數(shù)量有50個;遺傳信息處理通路有17個;環(huán)境信息處理通路所包含的差異蛋白有17個;其他19個差異蛋白參與的通路尚不清楚。3)String分析結(jié)果顯示,129個差異顯著蛋白之間存在直接和間接的相互作用。有的差異蛋白連接密集,有的連接松散。其中,secY、rpsE、isaB和PstB等蛋白與其它蛋白的相互作用關(guān)系≥5,它們是蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點,在蛋白轉(zhuǎn)運、核糖體合成、細(xì)胞免疫以及細(xì)菌耐藥方面發(fā)揮重要作用。(4)對檢測出的129個差異顯著蛋白,通過分析其分子功能,得到與耐藥相關(guān)的蛋白,并對其介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的機制進(jìn)行了探討。結(jié)果顯示,與細(xì)菌耐藥相關(guān)的蛋白約有14個,其中,PstB、PstC和PhoU等蛋白主要是通過主動外排系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)菌耐藥;PstS、altA和sarR等蛋白主要通過促進(jìn)細(xì)菌生物被膜的形成介導(dǎo)細(xì)菌耐藥。(5)利用蓄積動力學(xué)實驗、結(jié)晶紫半定量法和qRT-PCR法對PstB和PstS蛋白介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的機制進(jìn)行了驗證。1)蓄積動力學(xué)結(jié)果顯示,Pst系統(tǒng)抑制劑維拉帕米作用MRSA41577菌體后,與對照組相比,菌體內(nèi)環(huán)丙沙星的蓄積量明顯升高。其中,100?g/ml的維拉帕米作用菌體12 min后,環(huán)丙沙星的蓄積量比空白對照組增加了32%(P0.01)。由于PstB是外排泵的組成蛋白,表明維拉帕米逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥可能與抑制PstB蛋白的表達(dá)有關(guān)。qRT-PCR結(jié)果顯示,維拉帕米能抑制pstB基因的表達(dá)量。與對照組相比,100μg/ml維拉帕米作用MRSA41577菌體16 h后,pstB基因的表達(dá)量降低了89%(P0.01)。表明維拉帕米可通過抑制pstB的mRNA表達(dá)量來逆轉(zhuǎn)MRSA 41577耐藥。2)結(jié)晶紫半定量結(jié)果顯示,維拉帕米對MRSA41577生物被膜的形成和成熟的生物被膜均有一定的抑制作用。與對照組相比,100μg/ml的維拉帕米可使游離細(xì)菌和成熟生物被膜內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量均減少約25%(P0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,維拉帕米能抑制pstS mRNA的表達(dá)量。與對照組相比,100μg/ml維拉帕米作用MRSA41577菌體16 h后,pstS mRNA的表達(dá)量降低了90%(P0.01)。表明維拉帕米可能是通過抑制pstS的mRNA表達(dá)量抑制MRSA41577生物被膜的形成。
【學(xué)位授予單位】：遼寧師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R378.11
【圖文】：

0D1JQU00D1I1S80H3K6P1181EI95077UL906GB15033V6B7069G43567RMV8077UJU0Glycerophosphodiester phosphodiesteraseUncharacterized proteinTruncated triacylglycerol lipasePhosphate-binding lipoproteinSigmaB-controlled gene productUPF0337 proteinUncharacterized proteinAlkaline shock proteinSigmaB-controlled gene productCsbD-like family protein20282242611422 iTRAQ 結(jié)果驗證通過 qRT-PCR 法，檢測了差異顯著的上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白的基因表達(dá)水平RAQ 檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，下調(diào)蛋白 PstB mRNA 表達(dá)水平明顯降低，其基因表達(dá)量分別下降了 51.6%和 52.1%；上、Mip 和 RecT 的 mRNA 的表達(dá)量顯著性增加，與對照組相比，分別增加了和 90.1%（P＜0.01）(圖 2.1)�；虮磉_(dá)水平與蛋白表達(dá)水平的變化趨勢完全本研究的 iTRAQ 檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

基因注釋分析結(jié)果

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本文編號：2737737