【摘要】：狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的人和多種動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的急性傳染病,臨床發(fā)病后死亡率幾乎達(dá)到100%。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室先前的研究發(fā)現(xiàn),狂犬病毒糖蛋白(G)的第83、367位氨基酸對(duì)細(xì)胞適應(yīng)性及致病力至關(guān)重要。本研究以狂犬病毒SAD株為母本質(zhì)粒,運(yùn)用重疊延伸PCR和點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建K83R-rSAD、P367S-rSAD和K83R-P367S-rSAD三個(gè)重組病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒。成功拯救出包括SAD親本株及以上三個(gè)重組病毒,將重組病毒在細(xì)胞上連續(xù)傳代5代,測(cè)定F6代病毒的多步生長(zhǎng)曲線,在第72 h和第96 h時(shí)病毒滴度達(dá)到最高,K83R-rSAD為10~(8.5)FFU、P367S-rSAD為10~(7.5)FFU、K83R-P367S-rSAD為10~(8.5)FFU、SAD為10~(7.0)FFU,結(jié)果表明狂犬病毒糖蛋白第83位氨基酸突變后,狂犬病毒的滴度顯著升高。對(duì)重組病毒G基因測(cè)序結(jié)果表明K83R、P367S在連續(xù)五代內(nèi)穩(wěn)定遺傳。Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明G83突變后,G蛋白表達(dá)量明顯升高。將上述四株病毒以腦部注射的方式接種于昆明白乳鼠,乳鼠全部死亡。分離鼠腦病毒后,以肌肉注射的方式免疫C57BL/6小鼠,小鼠發(fā)病并有死亡現(xiàn)象。免疫SAD親本毒的小鼠全部死亡,免疫重組病毒K83R-rSAD、P367S-rSAD和K83R-P367S-rSAD后小鼠的存活率分別為72%、42.6%和63.6%,結(jié)果表明狂犬病毒G83和G367突變后能夠降低對(duì)C57BL/6小鼠的致病性。綜上所述狂犬病毒糖蛋白83和367位氨基酸的改變能夠降低對(duì)小鼠的致病性,同時(shí)第83位氨基酸改變后狂犬病毒糖蛋白表達(dá)量升高。本研究成功拯救出致病力更弱的重組狂犬病病毒,為今后研制狂犬病毒弱毒疫苗了奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R373
【圖文】：

圖 1.2 狂犬病病毒結(jié)構(gòu)圖[33]Figure 1.2 The Structure of Rabies Virus[33]的功能白都具有免疫原性，核蛋白 N 是由 450 個(gè)氨基白是狂犬病病毒的一種重要的保護(hù)性抗原，在不被 RNA 酶降解[34]。碼高度親水性的磷蛋白，并且 P 基因的 mRNAP1, 297 位氨基酸）和少量的 N 末端截短的 P酸序列分別對(duì)應(yīng)于 P1 在 20 ~ 297、53 ~ 297、有拮抗肌肉細(xì)胞中的 IFN 誘導(dǎo)的功能，能夠促神經(jīng)，在病毒的侵襲中具有重要作用[35]。同時(shí)制 I 型干擾素的抗病毒作用。P 蛋白是附著在

圖 1.3 狂犬病病毒反向遺學(xué)系統(tǒng)操作模式圖Figure 1.3 The schematic diagram of rabies virus reverse genetic operation system狂犬病病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立與發(fā)展，不僅對(duì)研究狂犬病病毒的致病機(jī)理提供有效途徑，而且能夠協(xié)助研究狂犬病病毒的各個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白與功能之間的關(guān)系。實(shí)際操作中可以通過(guò)點(diǎn)突變、基因刪除、插入、替換或重排 RABV 編碼的五個(gè)基因來(lái)改變 RABV 的基因組，再通過(guò)反向遺傳學(xué)獲得重組病毒，進(jìn)而研究影響 RABV 致病性的因素、病毒基因組與其功能之間的關(guān)系、基因組轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的機(jī)制以及病毒與宿主之間的相互作用等，為探索 RABV 減毒疫苗的開(kāi)發(fā)提供幫助。7 Overlap PCR 的原理與應(yīng)用7.1 Overlap PCR 原理傳統(tǒng)的基因克隆中，需要使用包含獨(dú)特限制性酶切位點(diǎn)的特異性引物對(duì)靶基因進(jìn)行 PCR

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