【摘要】：研究背景:血管新生,是由已有的脈管系統(tǒng)中生成新的血管,這需要內(nèi)皮細(xì)胞一系列的協(xié)調(diào)活動(dòng),例如增殖、遷移、結(jié)合形成血管樣的管腔結(jié)構(gòu)。這一過程是發(fā)生血管損傷后組織修復(fù)的關(guān)鍵步驟。已有多種疾病被證實(shí)可以引起脈管系統(tǒng)的損傷,最常見的有心血管疾病及慢性代謝性疾病,尤其是糖尿病的大血管及微血管并發(fā)癥。因此,修復(fù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)受損處的血管新生,在治療多種疾病引發(fā)的血管損傷方面具有十分重要的意義。此前,已有大量關(guān)于內(nèi)源性因素以及激素參與調(diào)節(jié)血管新生的報(bào)道。長期以來,大量研究表明適量有氧運(yùn)動(dòng)能夠有效預(yù)防和延緩多種心血管疾病和慢性代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展。2012年哈佛大學(xué)Spiegelman實(shí)驗(yàn)室的最新研究發(fā)現(xiàn)了一種新的肌肉因子—Irisin,Irisin是經(jīng)蛋白水解酶切除Ⅲ型纖連蛋白組件包含蛋白 5(fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 5,FNDC5)的 N 端信號(hào)肽后形成的約110個(gè)氨基酸大小的可分泌多肽片段。作為運(yùn)動(dòng)和代謝之間的聯(lián)系,Irisin被認(rèn)為具有增加體能消耗,減少身體重量,以及增加小鼠的胰島素敏感性等多種作用。在我們的前期研究結(jié)果中,我們闡明了 Irisin具有經(jīng)由ERK信號(hào)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用,同時(shí)它能夠部分性地保護(hù)細(xì)胞,使其免受高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。我們的這些發(fā)現(xiàn)表明,Irisin和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間存在一定的聯(lián)系。然而,目前尚未有研究證明Irisin是否直接參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的其他功能,如遷移和血管新生,其中可能涉及的分子機(jī)制及信號(hào)傳遞系統(tǒng)也尚未可知。研究目的:1.體外實(shí)驗(yàn)部分旨在探討重組Irisin蛋白對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移及小管新生的影響,并探尋此過程可能會(huì)涉及到的分子機(jī)制及信號(hào)通路。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分旨在進(jìn)一步證實(shí)重組Irisin蛋白對斑馬魚節(jié)間血管的血管新生存在促進(jìn)作用。研究方法:1.重組Irisin蛋白的表達(dá)純化;2.原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離提取與體外培養(yǎng);3.通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測重組Irisin蛋白對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力的影響;4.通過細(xì)胞新生管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測重組Irisin蛋白對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成能力的影響;5.通過斑馬魚節(jié)間血管生成實(shí)驗(yàn)檢測重組Irisin蛋白對斑馬魚損傷的節(jié)間血管新生能力的影響;6.通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測重組Irisin蛋白處理后參與此過程的相關(guān)基因的表達(dá)情況;7.通過Western印跡分析檢測重組Irisin蛋白處理后參與此過程的相關(guān)信號(hào)通路及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)情況;8.通過明膠酶譜法檢測重組Irisin蛋白處理后基質(zhì)金屬蛋白酶的活性;9.統(tǒng)計(jì)分析所得結(jié)果,采用t檢驗(yàn)比較不同組之間的差異;采用單向方差分析(ANOVA)比較不同試驗(yàn)組之間的數(shù)據(jù)。P0.05的差異被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果:1.Irisin促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移:(1)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組比較,在使用10nM和20nM兩個(gè)不同濃度的重組Irisin蛋白處理細(xì)胞12和24 h的實(shí)驗(yàn)組中,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移速度明顯加快,且表現(xiàn)出Irisin劑量依賴效應(yīng)。(2)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組比較,在使用10 nM和20 nM兩個(gè)不同濃度的重組Irisin蛋白處理24 h后,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的遷移能力,并同樣表現(xiàn)出Irisin濃度依賴效應(yīng)。2.細(xì)胞新生管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組比較,10 nM和20 nM兩個(gè)不同濃度的重組Irisin蛋白處理細(xì)胞6 h均能促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的小管形成,且重組Irisin蛋白濃度為20 nM組的小管形成數(shù)量和密度均更為明顯。3.斑馬魚節(jié)間血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,重組Irisin蛋白能夠減弱PTK 787化學(xué)誘導(dǎo)的斑馬魚節(jié)間血管損傷,并促使被抑制的節(jié)間血管重新生長。4.Irisin上調(diào)MMP-2以及MMP-9表達(dá)和活性:(1)實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果表明,重組Irisin蛋白處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和斑馬魚24 h后,均能夠顯著刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-2和MMP-9基因的表達(dá),并略微降低TIMP-1基因的表達(dá)。(2)Western印跡結(jié)果顯示,重組Irisin蛋白處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24 h后,MMP-2和MMP-9在蛋白水平表達(dá)也顯著上調(diào)。(3)明膠酶譜分析處理后發(fā)現(xiàn),重組Irisin蛋白可以增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌的MMP-2和MMP-9的活性。5.Irisin通過ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新生管腔形成:(1)Western印跡結(jié)果顯示,經(jīng)重組Irisin蛋白處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞5 min及10 min的時(shí)間點(diǎn),P-ERK的表達(dá)顯著升高。(2)用ERK的特異性抑制劑U0126處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后,Irisin誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和管腔形成被顯著抑制。6.ERK抑制劑對Irisin誘導(dǎo)的MMP-2以及MMP-9表達(dá)和活性的影響(1)Western印跡結(jié)果顯示,U0126處理后,Irisin誘導(dǎo)的MMP-2以及MMP-9的表達(dá)被顯著抑制。(2)明膠酶譜分析顯示,U0126處理后,Irisin誘導(dǎo)的MMP-2以及MMP-9的活性同樣被顯著抑制。結(jié)論:1.重組Irisin蛋白能夠促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移及新生管腔形成。2.重組Irisin蛋白能夠減輕PTK 787誘導(dǎo)的斑馬魚節(jié)間血管的損傷。3.ERK MAPK信號(hào)通路參與重組Irisin蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的功能及MMP-2/MMP-9的表達(dá)和活性。研究背景:順式-二氯二氨合鉑(Ⅱ)(cis-Dichlorodiamineplatinum(Ⅱ),臨床稱之為順鉑),屬于鉑類抗癌藥物。它與多種抗腫瘤藥物有協(xié)同作用,是多種實(shí)體腫瘤的一線化療藥物之一,常用于治療頭頸部癌、小細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、睪丸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等多種鱗狀上皮癌和惡性淋巴瘤。然而,順鉑在具有高效廣譜抗癌活性的同時(shí),也會(huì)對人體產(chǎn)生毒副作用,其中最主要的是其引起的劑量相關(guān)性腎臟毒性。嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起不可逆性的腎功能障礙及腎小管壞死。目前順鉑引起腎毒性的具體病理機(jī)制尚未完全明確,但廣泛認(rèn)為,腎小管上皮細(xì)胞攝入順鉑后會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的激活和炎癥因子的大量釋放,這是導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞壞死及腎臟組織損傷的主要原因。二氫楊梅素是從葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata,即藤茶)的葉片中提取出的主要活性成分,為天然黃酮類化合物。藤茶的莖葉被用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛等病癥在我國已有數(shù)百年歷史。以往的研究發(fā)現(xiàn),二氫楊梅素具有多種藥用功效,包括抗氧化和清除氧自由基的作用。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素能夠有效地減少抗癌藥多柔比星(也稱阿霉素)造成的大鼠原代心肌細(xì)胞的凋亡與活性氧的釋放,從而緩解急性心肌毒性并部分恢復(fù)心臟功能。但尚未有研究證明二氫楊梅素對順鉑引起的腎毒性損傷是否同樣有保護(hù)性作用。因此根據(jù)以往的研究結(jié)果,我們建立了順鉑誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的模型,觀察二氫楊梅素對順鉑誘導(dǎo)的腎組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤和氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用,以及二氫楊梅素對順鉑引起的腎小管上皮細(xì)胞HK-2凋亡及壞死的保護(hù)性作用。研究目的:1.觀察二氫楊梅素對順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和壞死的影響。2.建立順鉑誘導(dǎo)C57/BL6小鼠急性腎損傷模型,觀察二氫楊梅素對小鼠模型的保護(hù)性作用,并探討其中可能涉及的保護(hù)性機(jī)制。研究方法:1.WST-1和DAPI染色檢測HK-2細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡細(xì)胞數(shù)量;2.Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平3.建立順鉑誘導(dǎo)的C57/BL6小鼠急性腎損傷模型;4.檢測小鼠血清肌酐和尿素氮水平;5.檢測腎組織內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的水平;6.PAS和HE染色觀察腎組織的大體形態(tài)以及腎組織內(nèi)中性粒細(xì)胞的浸潤情況;7.免疫組織化學(xué)染色觀察腎組織內(nèi)DNA損害標(biāo)志物的表達(dá)情況;8.TUNEL染色檢測腎組織內(nèi)凋亡細(xì)胞的數(shù)量;9.實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測腎組織內(nèi)炎癥因子基因的表達(dá)水平;10.統(tǒng)計(jì)分析所得結(jié)果,每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。采用t檢驗(yàn)比較不同組之間的差異;采用單向方差分析(ANOVA)比較不同試驗(yàn)組之間的數(shù)據(jù)。P0.05的差異被視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果:1.二氫楊梅素保護(hù)順鉑引起的HK-2細(xì)胞凋亡:(1)WST-1檢測細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與順鉑單處理組相比,50μM二氫楊梅素共處理組細(xì)胞的增殖抑制率較低。(2)DAPI染色結(jié)果顯示,與順鉑單處理組相比,50 μM二氫楊梅素共處理組的細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。(3)Westernblot結(jié)果顯示,與順鉑單處理組相比,二氫楊梅素下調(diào)了促凋亡蛋白Bax的表達(dá),上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平。2.二氫楊梅素緩解了順鉑導(dǎo)致的腎臟毒性:(1)檢測不同組小鼠的血清尿素氮和血清肌酐結(jié)果顯示,單次順鉑注射3天后血清尿素氮和肌酐均顯著升高,而二氫楊梅素(500 mg/kg)與順鉑共處理組的結(jié)果有部分好轉(zhuǎn),并表現(xiàn)出二氫楊梅素濃度依賴效應(yīng)。(2)PAS染色結(jié)果顯示,順鉑單處理組小鼠腎小管出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)破壞和腎小管管型形成,而二氫楊梅素(500 mg/kg)與順鉑共處理組有明顯好轉(zhuǎn)。(3)TUNEL染色結(jié)果顯示,與順鉑單處理組相比,二氫楊梅素共處理組TUNEL陽性胞核數(shù)目明顯減少。3.二氫楊梅素對順鉑引起的氧化應(yīng)激的保護(hù)性作用:(1)8-OHdG免疫組化染色結(jié)果顯示,與順鉑單處理組相比,二氫楊梅素共處理組陽性胞核數(shù)目明顯減少。(2)對腎組織內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物的檢測結(jié)果顯示,與順鉑單處理組相比,二氫楊梅素共處理組MDA的水平有所下降,而SOD、CAT的水平有所升高。4.二氫楊梅素抑制順鉑引起的炎癥標(biāo)志物的表達(dá):(1)與順鉑單處理組相比,二氫楊梅素共處理組可以顯著降低炎癥因子IL-1β、TNF-α、MCP-1 的 mRNA 表達(dá)水平。(2)通過對HE染色中性粒細(xì)胞浸潤情況的半定量評(píng)分分析發(fā)現(xiàn),順鉑單處理組小鼠腎組織中的中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)目明顯多于二氫楊梅素共處理組。結(jié)論:1.二氫楊梅素能夠抑制順鉑誘導(dǎo)引起的HK-2細(xì)胞的凋亡。2.二氫楊梅素能夠緩解順鉑導(dǎo)致的小鼠急性腎毒性。3.二氫楊梅素對順鉑引起腎毒性的作用與抑制氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R363
【圖文】：

圖１．絲裂霉素Ｃ邋（ＭＭＣ）對重組Ｉｒｉｓｉｎ蛋白引起的ＨＵＶＥＣ細(xì)胞增殖的抑逡逑制作用。ＨＵＶＥＣ細(xì)胞分為Ｈ組加入處理：①２０邋ｎＭ重組Ｉｒｉｓｉｎ蛋白處理組；②逡逑５邋ｎｇ／ｍｌ絲裂霉素Ｃ與２０邋ｎＭ重組Ｉｒｉｓｉｎ蛋白共同處理組；⑤５帖／ｍｌ絲裂霉素Ｃ逡逑處理組。分別處理細(xì)胞至６，１２，邋２４及４８邋ｈ，用ＭＴＴ法檢測細(xì)胞存活率。ｎ＝３，逡逑巧邋＜０．０５。逡逑

圖２．細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示重姐Ｉｒｉｓｉｎ蛋白對ＨＵＶＥＣ細(xì)胞的ＨＵＶＥＣ細(xì)胞接種化６孔板上（１邋Ｘ邋１0６／孔），待細(xì)胞生長至融合右時(shí)，用無茜的一次性槍頭（２００川）刮擦細(xì)胞形成橫向的細(xì)細(xì)胞分為＾組加入處理：＠５邋ｎｇ／ｍｌ絲裂霉素Ｃ處理姐；＠５與１０邋ｎＭ重組Ｉｒｉｓｉｎ蛋白共同處理組；⑨５帖／ｍｌ絲裂霉素Ｃ與蛋白共同處理組。分別在賠育１２和２４邋ｈ的時(shí)間點(diǎn)，用倒置相劃痕區(qū)域的ＨＵＶＥＣ細(xì)胞進(jìn)行拍照，并統(tǒng)計(jì)各組各時(shí)間點(diǎn)劃痕面

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2734513